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在虾类低温冷冻保存研究中，基因表达分析前需确认合适的管家基因（HKGs）。研究人员针对珊瑚礁虾（Stenopus hispidus）胚胎开展研究，利用多种软件工具筛选。结果发现不同算法鉴定出的最适 HKGs 不同，该研究为后续虾类相关研究提供了重要参考。
在奇妙的生命科学领域，基因就像隐藏在生物体内的 “密码”，掌控着生物的各种特征和生命活动。而在虾类研究中，低温冷冻保存技术的发展对于虾类的种质资源保护等方面意义重大。然而，目前面临着诸多难题。一方面，很少有研究深入探究低温对虾及多数甲壳类动物基因表达的亚细胞影响；另一方面，在进行基因表达分析时，由于样本间逆转录过程效率存在差异，需要找到合适的管家基因（Housekeeping Genes，HKGs）作为内部对照，才能准确分析基因表达情况，但此前在虾类低温研究中，合适的 HKGs 尚未确定。
为了解决这些问题，来自高雄三军总医院妇产科、国防医学院三军总医院妇产科、国立东华大学海洋生物研究所等机构的研究人员展开了深入研究。他们以珊瑚礁虾（Stenopus hispidus）胚胎为研究对象，旨在筛选出适用于研究低温冷冻保存对其基因表达影响的最佳 HKGs。最终研究发现，不同分析算法鉴定出的最适合的 HKGs 有所不同，如 GeNorm 算法确定组蛋白 3（histone 3）和 18S 核糖体 RNA（18S rRNA）是最稳定的基因；NormFinder 算法表明 18S rRNA 在眼形成和孵化前阶段样本中较为稳定；Bestkeeper 算法则认为甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（gapdh）和 β - 肌动蛋白（β - actin）是最适合的基因。这一研究成果发表在《Scientific Reports》上，为后续研究低温冷冻保存对甲壳类动物基因表达的影响奠定了重要基础，有助于更深入地理解虾类在低温环境下的生理机制，推动虾类种质资源保护和冷冻保存技术的发展。
研究人员开展此项研究时，主要运用了以下几种关键技术方法：首先是定量实时聚合酶链反应（Quantitative real-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）技术，用于检测基因表达水平；其次是使用 GeNorm、NormFinder 和 Bestkeeper 等软件算法，来评估基因的稳定性；此外，研究中还涉及 RNA 提取和 cDNA 合成技术，为后续的基因检测提供样本基础。
下面来详细看看研究结果：
- 引物特异性：研究对 18S rRNA、ATPase、histone 3、β - actin 和 gapdh 这五个基因的引物进行设计和验证。通过与其他序列对比设计出 β - actin 和 gapdh 的引物，经常规 PCR 和凝胶电泳验证，这些引物能准确扩增目标序列，其凝胶电泳条带大小与预期相符，表明引物具有特异性，可用于后续 qRT-PCR 分析，有效减少实验误差。
- 定量实时 PCR 效率和 Ct 值分析：通过分析五个基因扩增循环产生的熔解曲线，发现均出现单峰，这表明引物和实时 PCR 的效率良好，不存在污染和引物二聚体等干扰。同时研究测定了不同样本、胚胎发育阶段及低温处理时间下各基因的 Ct 值（Ct 值表示样本的 qPCR 反应达到临界阈值所需的循环数）。结果显示，histone 3 的 Ct 值在所有样本中最低，表明其基因表达活性最高；ATPase 的 Ct 值最高，初始样本量相对最少。在胚胎发育的不同阶段，各基因 Ct 值变化不同，如在心跳期和孵化前期，18S rRNA、β - actin 和 gapdh 的 Ct 值呈特定顺序增加；而在眼形成阶段，gapdh 和 18S rRNA 的 Ct 值与其他阶段有所差异。在低温处理方面，histone 3 和 ATPase 的 Ct 值在不同处理时间下相对稳定，且 histone 3 的 Ct 值始终较低。
- 基因稳定性分析：运用 GeNorm、NormFinder 和 Bestkeeper 三种算法评估五个基因的稳定性。GeNorm 算法显示，在胚胎发育的眼形成、心跳和孵化前阶段，histone 3 和 18S rRNA 是最稳定的基因，在整体样本和不同低温处理组中也大多如此，但 16 小时低温处理组有所不同；该算法还确定 gapdh 和 β - actin 是最不稳定的基因。NormFinder 算法表明，18S rRNA 在眼形成和孵化前阶段最稳定，在心跳阶段 ATPase 稳定性最高；在低温处理组中，18S rRNA 在对照组和 4 或 32 小时处理组稳定性最高，8 或 16 小时处理组中 histone 3 和 ATPase 稳定性较高，且该算法结果与 GeNorm 算法一致，均显示 gapdh 和 β - actin 稳定性较低。然而，Bestkeeper 算法得出的结果与前两者差异较大，它认为 gapdh 和 β - actin 在整体样本、胚胎各阶段及低温处理期间是最稳定的基因。
综合研究结论和讨论部分，该研究首次针对虾类胚胎在低温环境下的 HKGs 进行筛选和研究，具有重要意义。研究确定了 histone 3 和 18S rRNA 是研究低温对 S. hispidus 胚胎影响的合适 HKGs，为后续相关研究提供了可靠的内参基因选择。虽然 ATPase 不适合作为 HKGs，但可作为研究虾类应对环境压力时细胞损伤的靶基因；gapdh 和 β - actin 在低温研究中稳定性欠佳，但 gapdh 在感染相关研究、β - actin 在细胞生长基因研究中可能具有潜在价值，不过这些还需进一步验证。该研究为未来虾类胚胎冷冻保存对基因表达影响的研究开辟了道路，尽管可能还有其他合适基因有待发现，但此次研究在该领域起到了开创性作用，为深入了解虾类低温生物学特性和冷冻保存技术优化提供了关键依据。
