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为解决结核分枝杆菌（Mtb）耐药及关键蛋白功能未知的问题，研究人员开展了对 Mtb 必需外排泵 EfpA 抑制机制的研究。结果揭示了两种抑制剂的不同抑制机制，表明 EfpA 可能是脂质转运蛋白，为联合抗结核治疗提供依据。
结核病，这个古老而又顽固的疾病，至今仍然是全球公共卫生的重大威胁。据世界卫生组织报告，2022 年结核病导致了 130 万人死亡，死亡率在所有细菌性疾病中高居榜首。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）作为结核病的病原体，随着耐药性的不断增强，现有的抗生素疗效逐渐被削弱，开发新型抗生素迫在眉睫。
在这样的背景下，来自美国加利福尼亚大学旧金山分校、麻省理工学院和哈佛大学 Broad 研究所等机构的研究人员，针对 Mtb 展开了深入研究。他们聚焦于 Mtb 中的必需外排泵 EfpA（Efflux protein A），旨在揭示其抑制机制，为抗结核药物研发开辟新路径。该研究成果发表在《Nature Communications》上，为抗击结核病带来了新的希望。
研究人员采用了多种关键技术方法。在蛋白结构解析方面，运用冷冻电镜（cryo-EM）技术，获取了 EfpA 与抑制剂结合的高分辨率结构；通过化学遗传筛选策略 PROSPECT（primary screening of strains to prioritize expanded chemistry and targets），鉴定出能够抑制 EfpA 的化合物；利用脂质组学分析，确定了与 EfpA 共纯化的脂质成分；借助分子动力学（MD）模拟，探究脂质分子与 EfpA 的结合及稳定性。
研究结果如下：
- EfpA 的结构测定：Mtb EfpA 是一种含有 14 个跨膜结构域（TM）的蛋白质，分子量为 55.58 kDa。研究人员通过在 EfpA 的 N 端添加 BRIL 结构域等手段，成功解析了其在不同状态下的结构。EfpA 以反平行二聚体和平行二聚体形式存在，其结构呈现出典型的主要促进超家族（MFS）转运蛋白折叠特征，两个 6 螺旋束（TM1-TM6 和 TM9-TM14）以伪二重对称排列，TM7 和 TM8 形成连接两个束的 linker 。
- 脂质识别的结构基础：在 EfpA 的结构中观察到脂质分子的密度，经脂质组学分析，推测这些脂质可能是磷脂酰甘油（PG）。MD 模拟显示，PG1 和 PG3 在 EfpA 中的结合较为稳定，而 PG2 的一条脂肪酸链暴露在周围胶束中，运动性较高。此外，通过对 361 株 Mtb 突变株的研究发现，EfpA 抑制剂与 PG 合成基因存在强烈的化学遗传相互作用，这表明 EfpA 可能参与了 PG 从内膜到外膜的转运过程。
- BRD-8000.3 的抑制机制：BRD-8000.3 与 EfpA 的结合亲和力通过配体检测质子 NMR 确定，其解离常数为 179±32 nM。cryo-EM 结构显示，BRD-8000.3 结合在靠近双层中心的隧道（隧道 2）中，它取代了 apo-EfpA 中 PG2 的位置，且结合位点由多个疏水氨基酸侧链组成。已知的耐药突变（V319F 或 A415V）会阻碍 BRD-8000.3 进入其结合位点，而过表达 EfpA 突变体 V319F 使 Mtb 对 BRD-8000.3 的 MIC90增加了 13 倍，V319A 突变则对药物敏感性无影响。
- BRD-9327 的抑制机制：BRD-9327 是另一种 EfpA 抑制剂，与 BRD-8000.3 的抑制机制不同。cryo-EM 结构表明，BRD-9327 结合在细胞外前庭内部，其结合口袋由多个特定氨基酸残基组成。在海洋分枝杆菌（M. marinum）中，赋予对 BRD-9327 耐药性的突变（如 A339T、G328C、G328D 和 F346L）均位于其结合口袋内。MD 模拟显示，F346TM10的苯环与 BRD-9327 的苄基溴部分形成 π-π 相互作用，F346L 突变会消除这种相互作用。BRD-9327 的结合会部分阻断底物运输，并抑制 EfpA 完成交替访问运输循环所需的动态运动。
研究结论和讨论部分指出，EfpA 作为 Mtb 中 MFS 超家族的唯一必需转运蛋白，其在药物耐药性和细菌生存生长中扮演着重要角色。本研究首次解析了 EfpA 的结构，揭示了其可能作为脂质转运蛋白的功能，为理解 EfpA 的生理作用提供了重要线索。同时，研究明确了 BRD-8000.3 和 BRD-9327 两种抑制剂的不同抑制机制，这为基于结构的药物设计提供了关键平台，有助于进一步优化化合物的疗效。此外，两种抑制剂的协同作用表明，针对同一靶点的化合物可用于组合药物设计，为抗结核治疗提供了新的策略，有望降低耐药性的产生。总之，该研究不仅加深了人们对 Mtb 关键蛋白的理解，更为开发新型抗结核药物奠定了坚实基础，在结核病防治领域具有重要的意义。
