Structural insights into the dual Ca2+ -sensor mediated activation of the PPEF phosphatase family：为 PPEF 相关疾病治疗策略开发点亮新光

在对丝氨酸 / 苏氨酸蛋白磷酸酶（PPEF）分子调控机制知之甚少的情况下，研究人员开展了关于 PPEF 家族激活机制的研究。通过冷冻电镜技术，发现了双Ca2+传感器介导的激活机制，为 PPEF 相关疾病治疗策略开发提供了理论依据。

　　在生命科学的微观世界里，蛋白质的可逆磷酸化就像一把神奇的钥匙，掌控着各种生物进程。丝氨酸 / 苏氨酸蛋白磷酸酶（PSPs）作为这把钥匙的重要组成部分，在细胞活动和疾病发生发展中扮演着关键角色。PSPs 分为多个家族，其中具有 EF 手型结构域的丝氨酸 / 苏氨酸蛋白磷酸酶（PPEF）家族，与癌症和神经元变性等疾病紧密相关。然而，长期以来，科研人员对 PPEF 的分子调控机制了解甚少，就像在黑暗中摸索，这极大地限制了人们对其生物学功能以及相关疾病的理解和治疗。

为了打破这一困境，来自深圳北京大学 - 香港科技大学医学中心、南方科技大学、中国科学院上海有机化学研究所等多个机构的研究人员，决定深入探索 PPEF 家族的奥秘。他们以果蝇视网膜变性 C（RDGC）为研究对象，因为它是 PPEF 家族的原型成员，对其进行研究有望揭开 PPEF 家族的神秘面纱。研究成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员为开展此项研究，主要运用了以下几种关键技术方法：一是冷冻电镜（cryo-EM）技术，利用该技术解析 RDGC/CaM 全酶的结构，直观地观察分子的形态和构象变化；二是尺寸排阻色谱结合多角度光散射（SECMALS）技术，用于研究蛋白质在Ca2+存在与否时的构象变化；三是等温滴定量热法（ITC）、GST 下拉实验（GST pull-down assays）和磷酸酶活性测定等生化实验方法，来探究蛋白质之间的相互作用以及磷酸酶的活性变化 。

研究结果如下：

• Ca2+对 RDGC/CaM 全酶磷酸酶活性的影响：研究人员利用 SF9 昆虫细胞共表达系统表达并纯化了 RDGC/CaM 全酶，通过实验发现，在 1 mM CaCl2存在的情况下，RDGC/CaM 全酶的磷酸酶活性显著增强，而在含有 1 mM EDTA（螯合Ca2+ ）的缓冲液中则活性较低，这表明Ca2+是 RDGC/CaM 磷酸酶活性的关键调节因子。同时，SECMALS 实验显示，Ca2+存在时 RDGC/CaM 全酶的洗脱体积减小，说明其发生了广泛的构象变化。
• 无Ca2+时自抑制状态下 RDGC/CaM 的结构：研究人员制备了无Ca2+的 RDGC/CaM 全酶样品，利用 cryo-EM 技术获得了分辨率为 3.6 ? 的密度图。结果显示，该全酶形成了一个异二聚体，其催化位点被延伸的 IQ 基序（extended-IQ motif）遮挡。CaM 与延伸的 IQ 基序的 N 端结合，EF 样 / EF 手型结构域串联与延伸的 IQ 基序的 C 端相互作用，共同稳定了自抑制构象，阻止底物进入催化位点。
• 有Ca2+时 RDGC/CaM 的结构：在含有 10 mM CaCl2的缓冲液中纯化全酶后，cryo-EM 分析得到了分辨率为 2.8 ? 的高分辨率图。此时，RDGC 和 CaM 形成了蝴蝶状的异四聚体，催化位点位于两个异二聚体形成的界面处。CaM 结合Ca2+后构象发生变化，延伸的 IQ 基序呈细长的杠杆臂构型，EF 手型结构域通过保守残基结合Ca2+ ，而 EF 样结构域未结合Ca2+ 。
• Ca2+结合诱导延伸的 IQ 基序构象变化：CaM 和 EF 样 / EF 手型结构域串联作为两个Ca2+传感器，协同作用诱导延伸的 IQ 基序发生翻转和弯曲。CaM 通过与延伸的 IQ 基序的多个位点相互作用，对其构象变化起关键作用；EF 样 / EF 手型结构域串联则通过与延伸的 IQ 基序的特定区域相互作用，进一步推动其构象变化，从而暴露催化位点。
• Ca2+对 RDGC/CaM 全酶调控的结构见解：研究发现，在无Ca2+时，CaM 和 EF 样 / EF 手型结构域串联结合延伸的 IQ 基序，使全酶处于自抑制构象；而Ca2+结合后，CaM 和 EF 样 / EF 手型结构域串联构象变得更加紧凑，产生的机械力使延伸的 IQ 基序翻转，暴露催化位点，且催化域结构变化较小，说明酶活性变化主要由调节亚基介导。
• 哺乳动物 PPEF 中保守的双Ca2+传感器介导的激活机制：序列比较和预测建模表明，PPEF 与 RDGC 在一级序列、二级结构以及关键结合位点上具有高度相似性，生化实验也证实了 PPEF1 在Ca2+存在时磷酸酶活性增加，且Ca2+传感缺陷突变体会显著降低其活性，这表明双Ca2+传感器介导的激活机制在 PPEF 家族中是保守的。
• CaM 和 EF 样 / EF 手型结构域串联与延伸的 IQ 基序结合模式的比较：延伸的 IQ 基序是 RDGC 的标志性结构，CaM 和 EF 样 / EF 手型结构域串联与延伸的 IQ 基序的结合模式既有相似性又有差异。两者在结构上具有相似的半开放构象，但空间排列不同，CaM 通过旋转的 C 形包裹运动与延伸的 IQ 基序两侧结合，而 EF 样 / EF 手型结构域串联则是与延伸的 IQ 基序并排接触。
• PPEF 与 PP2B 的Ca2+传感激活机制比较：PP2B 是另一种受Ca2+和 CaM 调节的磷酸酶，与 PPEF 相比，两者的激活机制存在显著差异。在 PP2B 的非活性状态下，CaM 不与其结合，而在 RDGC 的非活性状态下，CaM 仍与其结合，使酶能够快速响应细胞内Ca2+水平的变化。此外，两者的Ca2+传感器也不同，在活性状态下，PP2B 的Ca2+传感器 CnB 与催化域断开连接，而 RDGC 的Ca2+负载的 EF 手型结构域则与催化域连接并协同作用。
• RDGC/CaM 全酶异四聚体形成的意义：cryo-EM 分析表明，在 25 μM 浓度下，RDGC/Ca2+ -CaM 全酶颗粒为异四聚体，这在生理条件下是可行的。在果蝇微绒毛中，RDGC 和 TRP 的浓度使得异四聚体能够形成。同时，研究还发现溶液中存在异二聚体和异四聚体的动态平衡，且在不同浓度下两者的存在形式有所不同，此外，RDGC/Ca2+ -CaM 异四聚体下方存在未识别的电子密度，有待进一步研究。
• PPEF 家族的工作模型：基于以上研究结果，研究人员提出了 PPEF 家族的工作模型。在无Ca2+时，CaM 和 EF 样 / EF 手型结构域串联结合延伸的 IQ 基序，阻碍催化位点，导致催化位点自抑制；Ca2+流入后，CaM 和 EF 样 / EF 手型结构域串联发生构象变化，使延伸的 IQ 基序弯曲，解除自抑制，暴露催化位点。异四聚体全酶的形成可能代表了完全激活前的预激活状态，后续底物结合可诱导 RDGC/CaM 全酶单体形成，从而实现完全激活。

研究结论和讨论部分指出，该研究首次揭示了 PPEF 家族的双Ca2+传感器介导的激活机制，为理解 PPEF 家族的生物学功能提供了重要的结构基础。这种保守的激活机制在哺乳动物 PPEF 中也存在，为研究相关疾病的发病机制和开发潜在的治疗策略提供了新的方向。同时，与 PP2B 激活机制的比较，进一步加深了人们对不同磷酸酶激活方式的理解。此外，RDGC/CaM 全酶异四聚体的形成及其意义的研究，为后续研究提供了新的思路。然而，研究中发现的异四聚体下方未识别的电子密度以及Ca2+负载的 EF 手型结构域与催化域连接的功能后果等问题，仍需要进一步深入研究。总之，这项研究为 PPEF 家族的研究开辟了新的道路，有望在未来为相关疾病的治疗带来新的突破。