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为解决天然产物土荆酸 A（PAA）潜在分子靶点不明阻碍其发展的问题，研究人员开展了 PAA 靶点鉴定与验证的研究。他们结合化学蛋白质组学等技术，发现亚甲基四氢叶酸脱氢酶 1?样蛋白（MTHFD1L）是 PAA 的靶点，这为 PAA 的结构设计和修饰提供了新方向。
在生命科学和健康医学领域，天然产物一直是药物研发的重要源泉。许多天然产物具有独特的生物活性，有望成为治疗各种疾病的有效药物。然而，目前面临的一大难题是，对于这些天然产物发挥作用的具体机制，尤其是它们在体内的分子靶点，我们了解得还十分有限。这就如同在黑暗中摸索，虽然知道手中的 “钥匙”（天然产物）有开启治愈之门的潜力，但却找不到对应的 “锁孔”（分子靶点），极大地阻碍了基于天然产物的药物开发进程。
土荆酸 A（Pseudolaric acid A，PAA）作为从传统中药土荆皮中提取的主要生物活性成分，展现出了令人瞩目的抗癌活性。自 17 世纪起，土荆皮就被用于治疗真菌性皮肤感染，而其中的 PAA 更是具有抗真菌、抗生育以及抗癌等多种功效。然而，尽管 PAA 的多种生物活性已被发现许久，但其发挥抗癌作用的精确分子靶点以及相关机制却如同迷雾，一直未被揭开。此前研究虽发现 PAA 具有 HSP90 抑制活性，但该抑制活性与它对大多数癌细胞的作用存在显著差异，这暗示着还有其他重要的蛋白质靶点参与其中，亟待被发现和研究。
为了攻克这一难题，中国科学院昆明植物研究所的研究人员展开了深入研究。他们通过一系列实验，成功鉴定并验证了亚甲基四氢叶酸脱氢酶 1?样蛋白（Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 1?like，MTHFD1L）是 PAA 的关键靶点。这一发现意义重大，为基于 PAA 的抗癌药物的结构设计和修饰提供了全新的方向，就像是为在黑暗中摸索的药物研发者们点亮了一盏明灯。该研究成果发表在《Natural Products and Bioprospecting》杂志上。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是基于活性的蛋白质谱（Activity-based protein profiling，ABPP）和药物亲和反应靶点稳定性（Drug affinity responsive target stability，DARTS）技术，这两种技术相结合，用于筛选 PAA 的潜在靶点；其次，利用核磁共振（NMR）和表面等离子共振（SPR）技术，来验证 PAA 与 MTHFD1L 之间的直接相互作用；此外，还运用了转录组分析和网络药理学分析，以深入了解 PAA 对相关基因表达通路的影响。
下面来详细看看研究结果：
- 潜在结合蛋白的鉴定：
- DARTS 方法：研究人员以 HeLa 细胞（宫颈癌细胞系）为研究对象，鉴于 PAA 在 HeLa 细胞中展现出显著的抗肿瘤活性（IC50=2.92±0.36 μM），他们采用基于蛋白质热稳定性变化的无标记靶点鉴定方法 ——DARTS 技术，来探寻 PAA 在 HeLa 细胞中的蛋白质靶点。通过优化不同的链霉蛋白酶与蛋白质的比例，对水解条件进行调整。当小分子 PAA 与蛋白质结合时，会使目标蛋白质更加稳定，从而增强其对蛋白酶的抗性。经过 LC-MS/MS 分析消化后的肽段样本，并在 Mascot 数据库中进行搜索，最终确定了 42 种潜在的结合蛋白。
- ABPP 方法：为了进一步筛选 PAA 的潜在结合蛋白，研究人员运用了基于活性的蛋白质质谱（ABPP）策略。他们使用之前研究中设计的 PAA 探针，该探针与 PAA 具有相似的生物活性，并设置了死探针作为阴性对照。将 HeLa 细胞蛋白质组分为三组进行研究，分别是对照组（10 μM 死探针）、PAA 探针组（10 μM PAA 探针）和竞争组（500 μM PAA 预处理后再加入 10 μM PAA 探针）。通过观察 SDS-PAGE 胶上的荧光强度来判断是否存在竞争效应，最终对 40 - 55 kDa、70 - 80 kDa 和 90 - 130 kDa 范围内的条带进行切割，并进行定量测序。经过两次重复实验，共鉴定出 18 种潜在的结合蛋白。
- 关键靶点的确定及分析：在两种不同策略检测到的所有潜在结合靶点中，MTHFD1L 蛋白是唯一重叠的靶点，因此被认为是 PAA 最具潜力的结合靶点。MTHFD1L 作为人类线粒体 C1 - 四氢叶酸合酶，在一碳循环代谢中起着核心作用，催化四氢叶酸（THF）在线粒体中转化为 10 - 甲酰基四氢叶酸（10 - CHO - THF）。通过对癌症基因组图谱（TCGA）数据库和基因型 - 组织表达（GTEx）数据库的数据挖掘，研究人员发现 MTHFD1L 在多种癌症亚型和配对的正常组织中存在差异表达。在宫颈癌（CESC）细胞系中，MTHFD1L 呈现高表达状态，并且生存分析表明，它与 CESC 患者的不良预后密切相关。
- 相互作用的验证及结合模式分析：
- 相互作用验证：研究人员利用核磁共振饱和转移差异（NMR STD）和表面等离子共振（SPR）技术，从分子层面验证了 MTHFD1L 与 PAA 之间的直接相互作用。NMR STD 研究表明，PAA 与目标蛋白 MTHFD1L 直接相互作用，且其 - OAc 部分和 H - 17 紧密面向蛋白质表面。SPR 结合实验则进一步证实了两者之间的直接相互作用，并通过稳态亲和力分析得到平衡解离常数（Kd）约为 4.05 μM，表明 PAA 和 MTHFD1L 属于快速结合和快速解离的结合模式。
- 结合模式分析：为了深入了解 PAA 与 MTHFD1L 之间可能的结合机制，研究人员运用 Autodock 进行分子对接分析。由于 MTHFD1L 的晶体结构尚未公布，他们采用 AlphaFold2 预测其三维结构。结果显示，PAA 能够很好地定位在 MTHFD1L 预测的 ATP 结合口袋内，结合能为 - 7.88 kcal/mol。进一步分析发现，PAA 的 H - 1’和 H - 19 嵌入在 ATP 结合口袋中心，C - 19 与 MTHFD1L 的 M613、L616 和 A617 残基形成疏水相互作用，C - 4（C - 1’基团）的羰基与 H678 的侧链形成氢键，C - 17 甲基与由 L485、P455 和 V677 残基形成的疏水口袋相互作用。这些相互作用共同稳定了 PAA 在 ATP 结合口袋中的位置。
- 抗肿瘤机制研究：
- ROS 的介导作用：活性氧（ROS）作为线粒体的代谢产物，其积累与肿瘤细胞死亡的调控密切相关。高水平的 ROS 会对细胞成分造成不可逆的损伤，进而导致细胞凋亡和死亡。研究人员发现，PAA 处理 HeLa 细胞后，ROS 水平呈现浓度依赖性增加。同时，使用 ROS 清除剂 N - 乙酰半胱氨酸（NAC）预处理 HeLa 细胞，能够显著恢复细胞活力，这表明 PAA 诱导的肿瘤细胞死亡是通过刺激 ROS 积累来实现的，ROS 是 PAA 发挥抗肿瘤活性的关键介导因素。
- MTHFD1L 的功能研究：通过对 MTHFD1L 进行敲低实验，研究人员发现 HeLa 细胞的活力显著降低，这与之前在结直肠癌和甲状腺乳头状癌中的研究结果一致，即 MTHFD1L 的敲低会抑制细胞增殖。但这也在一定程度上限制了对 PAA 在 MTHFD1L 敲低细胞中抗肿瘤活性的评估。
- 综合分析：研究人员通过 RNA 测序评估 PAA 对 HeLa 细胞基因表达的总体影响。结果显示，PAA 处理后，有 442 个基因上调，580 个基因下调。基因本体（GO）生物学过程分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析表明，PAA 影响了广泛的生物学功能，包括蛋白质折叠 / 重折叠、对未折叠蛋白 / 拓扑错误蛋白的反应、热休克蛋白结合等，同时还调节了氨基酸的生物合成、酪氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等途径，进一步支持了 PAA 对一碳单位代谢的调节作用。
在这项研究中，研究人员综合运用标记的 ABPP 策略和无标记的 DARTS 技术，成功鉴定出 PAA 在 HeLa 细胞中的潜在靶点 MTHFD1L，并进一步验证了两者之间的直接相互作用，分析了其潜在的结合模式。转录组和网络药理学分析则深入揭示了 PAA 对相关基因表达通路的影响。虽然不能排除其他靶点也参与 PAA 抗癌活性的可能性，但该研究为 PAA 的进一步开发和利用奠定了重要基础，为基于天然产物的抗癌药物研发提供了新的思路和方向。它就像一把钥匙，为打开 PAA 在癌症治疗领域的大门提供了可能，有望推动相关领域的进一步发展，为攻克癌症这一难题带来新的希望。
