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这篇研究利用斑马鱼感染模型筛选 131 个白色念珠菌（Candida albicans）突变体，发现多个低毒力突变体影响先天免疫反应。其中，NMD5是新的毒力因子，其作用主要是限制吞噬作用，为理解念珠菌感染机制及防治提供新思路。
引言
白色念珠菌（Candida albicans）是美国常见的血流感染病原体，可在人体多个部位共生，也能引发从黏膜感染到致命全身感染等多种疾病，死亡率约 25%。宿主先天免疫系统在对抗白色念珠菌全身感染中起关键作用，但白色念珠菌有多种机制逃避宿主免疫攻击，目前对其在脊椎动物感染中如何调控免疫细胞招募和吞噬的了解较少。
斑马鱼幼虫模型适合研究白色念珠菌与脊椎动物先天免疫反应的相互作用。其透明度高且有多种转基因品系，便于对感染免疫反应进行定量成像，同时体积小、繁殖力强，利于在脊椎动物模型中进行经济高效的高通量筛选。已有研究表明，斑马鱼早期吞噬细胞反应对抵抗白色念珠菌后脑室感染至关重要，且白色念珠菌能限制吞噬细胞招募，该过程可能与酵母 - 菌丝转变有关。
本研究旨在利用斑马鱼感染模型，筛选影响白色念珠菌早期吞噬细胞反应的新因子。通过对 131 个工程化白色念珠菌突变体进行毒力缺陷筛选，并进一步分析其与吞噬细胞的相互作用，以揭示白色念珠菌毒力基因通过限制早期先天免疫反应介导发病机制的新机制。
结果
基于毒力丧失的正向遗传筛选以寻找改变的真菌免疫逃逸机制
白色念珠菌在感染过程中会限制免疫细胞招募和吞噬，但具体分子机制不明。斑马鱼后脑感染模型可用于活体成像观察早期真菌和宿主动态变化，且早期吞噬细胞对真菌的控制与宿主生存密切相关。研究人员利用该模型，对白色念珠菌突变体进行毒力和吞噬缺陷筛选。
首先用少量突变体确定感染参数，这些突变体在体外具有正常竞争适应性，包括细胞壁缺陷（mnn15?/?、mnt1?/?）、丝状生长缺陷或与吞噬细胞相互作用改变（mad2?/?、ece1?/?、pra1?/?）以及在小鼠模型中低毒力的突变体。在初始毒力测试中，每个突变体约感染 50 条鱼，与对照组一起进行至少三次生物学独立实验，通过荧光显微镜计数接种物，并监测 3 天内鱼的生存情况。结果发现，ssu81?/?、mad2?/?和rbt1?/?968 - 2166三个突变体毒力显著降低或丧失，其中mad2?/?的吞噬率显著高于对照组，rbt4?/?虽吞噬效率低但与生存无关联。
随后，研究人员对 131 个突变体进行大规模筛选，这些突变体根据之前筛选的表型分为形态发生缺陷（在 Spider 培养基上菌丝生长缺陷但毒力无缺陷）、感染性缺陷（在小鼠混合感染中有竞争缺陷但在 Spider 培养基上形态发生无缺陷）和预测分泌蛋白相关（编码预测分泌肽但在 Spider 培养基上形态发生和混合感染毒力均无缺陷）三类。在初步筛选中，因要进行高通量筛选细胞自主毒力缺陷，未对接种物计数且未设重复。毒力测试发现多个毒力显著降低的突变体，根据 z - 评分（基于与野生型感染均值的偏差），17 个突变体鱼存活率 z - 评分 > 3，27 个在 2 - 3 之间。对 z - 评分 > 3 的低毒力突变体重新测试，包括筛选每条鱼的接种物、检测独立分离株和基因分型，最终得到 10 个可重复低毒力的突变体。对这些突变体进行互补实验，部分突变体（brg1?/?、pep8?/?、nmd5?/?、rim101?/?、cek1?/?、apm1?/?和mad2?/?）的毒力至少部分恢复，且部分突变体在体外的丝状生长和 pH 依赖的丝状化表型也得到部分恢复。将可互补的突变体转化为表达近红外荧光蛋白的菌株，用于感染的活体成像，最终得到 7 个毒力缺陷可至少部分互补的突变体。
低毒力白色念珠菌突变体引发的早期吞噬细胞反应改变
先前研究表明，早期对真菌的有效免疫吞噬与宿主生存增强相关。为确定这些突变体的毒力缺陷是否与更有效的早期免疫反应有关，研究人员对感染 iRFP 表达的白色念珠菌的 * Tg (mpeg1:GFP)/(lysC:dsRed)* 斑马鱼幼虫（绿色巨噬细胞和红色中性粒细胞）在 4 - 6 小时进行成像，评估巨噬细胞和中性粒细胞对感染的快速反应数量以及吞噬白色念珠菌的能力。
结果发现，7 个验证的低毒力突变体均引发了急性免疫反应改变，根据感染部位免疫细胞计数和吞噬效率，突变体表型可分为 4 组。Group I 中的mad2?/?、rim101?/?和brg1?/?突变体吞噬更有效，4 - 6 小时感染部位吞噬细胞数量更低；Group II 中的pep8?/?和apm1?/?突变体吞噬效率不变但免疫细胞减少；Group III 中的nmd5?/?突变体吞噬增加但吞噬细胞数量不变；Group IV 中的cek1?/?突变体吞噬增加且吞噬细胞计数增加。
进一步分析发现，Groups I、II 和 IV 的突变体在 4 - 6 小时感染部位的吞噬细胞数量与野生型感染相比有显著变化，cek1?/?感染引发更多总吞噬细胞和巨噬细胞，而brg1?/?、pep8?/?感染的巨噬细胞数量减少，mad2?/?、rim101?/?和pep8?/?感染的中性粒细胞数量减少。Groups I、III 和 IV 的突变体吞噬细胞内化真菌的能力总体增强，nmd5?/?在多个真菌内化指标上表现更优，其他一些突变体也至少在一个吞噬指标上有增加。
感染早期突变体的真菌形态缺陷与先天免疫反应改变无关
由于菌丝比酵母更难被吞噬，且 7 个低毒力突变体中有 5 个之前在 Spider 培养基上有丝状生长表型，研究人员分析了这些突变体在感染后 4 - 6 小时体内丝状形态转换情况。结果发现，4 个在体外丝状化减少的突变体（rim101?/?、brg1?/?、pep8?/?和apm1?/?）在体内早期丝状细胞数量减少，而cek1?/?、nmd5?/?和mad2?/?在丝状生长上无显著减少。早期吞噬与抑制萌发和低毒力相关，但只有rim101?/?在丝状生长减少的同时吞噬率更高，说明其他三个突变体在体内丝状生长减少可能是由于其本身在感染期间转换为丝状生长的能力降低。且早期感染时，先天免疫反应（招募或吞噬效率）的显著改变与丝状生长转换能力的降低之间没有一致性。
低毒力白色念珠菌突变体引发的细胞因子反应改变
研究人员推测这些免疫反应的改变可能伴随着促炎细胞因子和趋化因子表达的改变。由于brg1?/?、pep8?/?和nmd5?/?突变体的免疫招募和吞噬变化最明显且属于不同类别，研究人员测量了这些感染中炎症基因的诱导情况，检测了白细胞介素 - 1β（IL - 1β）、肿瘤坏死因子 α（TNF - α）和斑马鱼 IL - 8 同源物的表达。4 小时时，促炎基因表达无显著诱导，但 24 小时时出现强烈诱导。24 小时时，brg1?/?或pep8?/?感染的鱼中，cxcl8b、tnfa和il1b的诱导显著降低，nmd5?/?感染的鱼中cxcl8b和il1b诱导显著降低但tnfa无变化。nmd5?/? + NMD5感染的鱼促炎趋化因子 / 细胞因子产生增加，与该互补菌株感染鱼的存活率降低和完全互补表型相符；brg1?/? + BRG1和pep8?/? + PEP8的基因表达介于野生型和突变体之间，与部分互补的毒力表型相符。
NMD5仅在存在完全活跃的免疫攻击时对毒力至关重要
鉴于nmd5?/?感染与更强的吞噬作用和感染控制相关，且其在白色念珠菌中的作用此前未被描述，研究人员探究其在毒力中的主要作用是否为免疫逃逸。在酿酒酵母中，ScNmd5p 参与ScHog1p 和ScCrz1p 的核转运，ScNMD5突变体对多种盐胁迫敏感。但在白色念珠菌中，nmd5?/?在常规 YPD 平板上形成较小菌落，在多种胁迫条件下生长能力未改变。
研究人员通过多种方式测试免疫反应受限对nmd5?/?毒力的影响。用地塞米松（一种调节斑马鱼巨噬细胞活性的免疫抑制剂）处理感染鱼，结果显示nmd5?/?在对照条件下比野生型 SN250 毒力低，地塞米松免疫抑制增加了nmd5?/?的毒力，消除了其与野生型的毒力差异。选择性灭活 NADPH 氧化酶（敲低 p47phox）以减少吞噬细胞招募和吞噬，结果nmd5?/?在对照 STD 吗啉代条件下毒力低于 SN250，p47phox吗啉代处理使nmd5?/?毒力增加，消除了其与 SN250 感染鱼的生存差异。在卵黄感染（免疫反应比后脑感染延迟 / 较弱）中，nmd5?/?与 SN250 的毒力无显著差异。这些结果表明，当先天免疫受限，nmd5?/?与野生型 SN250 毒力相同，其毒力缺失是由于无法逃避免疫反应。
讨论
白色念珠菌通过多种方式逃避免疫清除，但对其在脊椎动物感染中各机制的影响及相关真菌基因和途径了解较少。斑马鱼幼虫模型的透明度高和成本效益优势，使其成为研究白色念珠菌免疫逃逸机制的有力工具。本研究利用该模型对 131 个白色念珠菌突变体进行毒力筛选，并分析早期免疫介导的真菌吞噬作用，鉴定出多个新的和已知的毒力基因在限制感染部位先天免疫反应中的新作用，还确定NMD5为新的毒力因子，其功能与免疫逃逸相关。
这是首次在脊椎动物感染模型中对 100 多个白色念珠菌单个突变体进行单突变感染筛选，克服了以往混合筛选的缺陷。研究中鉴定的 7 个突变体中，部分已在小鼠单菌株尾静脉感染中测试，均表现为低毒力，且多数在混合筛选中未被发现。斑马鱼和小鼠结果的高度一致性，表明感染机制在两者中具有保守性，未在小鼠中测试毒力的APM1、PEP8和NMD5可能在小鼠（和人类）疾病中也很重要。
斑马鱼可进行活体观察早期先天免疫反应，研究人员据此将低毒力突变体分为 4 类。多数突变体（Classes I、III 和 IV）中，吞噬效率增加与低毒力相关。一些突变体感染时，吞噬细胞数量不变或减少，但真菌吞噬水平与或超过野生型，这可能导致早期有效吞噬限制后期吞噬细胞招募，最终使后期炎症基因表达降低。
细胞壁和真菌形态调节巨噬细胞和中性粒细胞的吞噬作用，BRG1和PEP8虽与白色念珠菌毒力相关，但此前未被确定调节免疫反应。它们在体内丝状细胞产生减少，可能导致早期真菌吞噬增加。NMD5突变体在感染中早期吞噬效率显著增加，其在白色念珠菌中的功能与酿酒酵母不同，与免疫逃逸密切相关，后续研究可进一步探究其在核转录因子转运中的作用及相关转录模式差异。
本研究通过斑马鱼活体成像研究白色念珠菌与先天免疫的相互作用，鉴定出多个新的低毒力突变体，描述了其早期免疫逃逸相关表型，确定NMD5为重要毒力因子。未来在斑马鱼中进行高时空分辨率的活体时间推移实验，将进一步揭示吞噬细胞与这些突变体的相互作用，为理解脊椎动物宿主念珠菌病早期事件的保守调节机制提供更多信息。
材料和方法
白色念珠菌菌株和生长条件
用于筛选的白色念珠菌突变体菌株来自 Noble 文库。感染实验时，菌株在 30°C 的酵母 - 蛋白胨 - 葡萄糖（YPD）琼脂上生长，挑取单菌落接种于液体 YPD 中过夜培养，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）重悬，必要时用 Calcofluor white 染色，调整浓度至 1×107 CFU/mL 用于注射。用于成像的菌株用 pENO1 - iRFP - NATr转化，筛选出最亮的分离株并确认整合位点。使用 SAT - flipper 方法构建 SN250 中RBT1的完全缺失突变体。
突变体菌株的互补
互补构建体从 GenScript 或 Twist Bioscience 订购，用适当限制酶切割后通过 LiAC 转化导入突变体，以ARG4自养型拯救为选择标记，通过 PCR 确保正确整合。对有已知形态发生缺陷的突变体，在 Spider 培养基或不同 pH 的 M199 培养基中评估其生长情况，以检查功能互补。
nmd5?/?在不同培养基上的生长以评估盐耐受性
将nmd5?/?过夜培养物接种到新鲜 YPD 中培养 4 小时，进行 10 倍系列稀释后点在不同培养基平板上，包括 YPD、不同 pH 的 M199、添加不同盐或氧化应激剂的 YPD 等，在 30°C 孵育 48 小时，在 24 小时和 48 小时成像，每个菌株重复 3 次。
斑马鱼的饲养和维护
成年斑马鱼在缅因大学斑马鱼设施中饲养，温度 28°C，光照周期 14 小时 / 10 小时，喂食 Hikari 微颗粒饲料。实验用斑马鱼品系包括 AB 野生型和Tg(mpeg1:EGFP)/Tg(lysC:dsRed)。
斑马鱼感染
斑马鱼胚胎在 33°C 培养 24 小时，前期用 E3 加亚甲基蓝，之后用 E3 加 1 - 苯基 - 2 - 硫脲（PTU）。24 小时受精后去卵膜，将白色念珠菌制备成 1×107 cells/mL 的注射溶液，必要时用 Calcofluor white 染色。在 prim - 25 阶段，用三卡因麻醉胚胎进行后脑或卵黄感染，感染后置于 30°C，监测 72 小时内的生存情况，筛选确保每条鱼感染 10 - 25 个白色念珠菌细胞。
大规模毒力筛选
大规模毒力筛选时，每个实验测试 5 个白色念珠菌突变体，同时设 SN250 野生型对照和 PBS mock 感染对照，约 50 条鱼 / 菌株。因注射鱼数量多，未筛选接种物且未染色，若 SN250 感染鱼 72 小时存活率不在 5.3% - 72.18% 范围内，则重新测试所有突变体菌株。
地塞米松处理
地塞米松实验中，在感染前 1 小时将地塞米松（终浓度 50 μg/mL）或 DMSO（载体对照，终浓度 0.5%）加入 E3 + PTU 中，持续整个实验，后脑感染操作同前。
吗啉代注射
在 1 - 4 细胞期，用标准或 p47phox吗啉代（分别为 1 ng/nL 和 2.5 ng/nL）注射胚胎，注射溶液含 0.3×Danieau 缓冲液、0.16% 荧光葡聚糖和 0.001% 酚红。注射后鱼
