探秘致病真菌 Lomentospora prolificans：黑色素合成多样性及其对健康威胁的新认知

本文聚焦丝状真菌 Lomentospora prolificans（L. prolificans）。研究发现其能产生多种黑色素，包括 DHN - 、DOPA - 、pyomelanin 等，还可能存在新型黑色素。这一成果有助于深入理解其致病机制，为攻克相关感染性疾病提供关键线索。

　　### 引言
Lomentospora（曾用名 Scedosporium）prolificans 是一种对免疫功能低下患者极具威胁的真菌病原体，常见于患有恶性肿瘤或接受实体器官移植的人群。它对所有系统活性抗真菌药物都具有耐药性，导致患者死亡率居高不下。

黑色素作为一种在生物界广泛存在的天然生物聚合物，具有多种重要功能，比如捕获电磁能量、保护微生物免受不良环境影响，同时它也是许多致病真菌和细菌的毒力因子。黑色素主要分为几类，包括由儿茶酚胺氧化产物聚合而成的真黑素（eumelanin）；由氧化的儿茶酚胺与含半胱氨酸的氨基酸聚合产生的褐黑素（pheomelanin）；源自酪氨酸分解代谢和尿黑酸（HGA）聚合的焦黑素（pyomelanin）；以及通过聚酮合成途径由聚合的乙酰辅酶 A 产生的二羟基萘黑色素（DHN - melanin）。在真菌王国中，主要的黑色素类型是 DOPA 黑色素和 DHN 黑色素 ，部分真菌还能产生多种黑色素。

尽管此前有研究报道 L. prolificans 分生孢子能合成 DHN - 黑色素，但对该真菌黑色素的结构、合成及功能的研究仍不充分。以往研究方法存在局限性，如依赖间接实验和工具，无法全面准确地了解其黑色素的特性。因此，本研究旨在重新探究 L. prolificans 的黑色素形成问题。

材料和方法

1. 真菌菌株、细胞生长和培养条件：实验采用的 L. prolificans 菌株来自澳大利亚一名 11 岁男孩的临床分离株，具有天然抗真菌耐药性。该菌株在马铃薯葡萄糖（PD）肉汤中培养 14 天以获取足够的真菌生物量，在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上培养 7 天可收获分生孢子。
2. 试剂：实验使用了多种黑色素合成抑制剂，如抑制 DHN - 黑色素合成的咯喹酮（pyroquilon）和三环唑（tricyclazole）；抑制 DOPA - 黑色素合成的烟酸（niacin）；抑制 pyomelanin 合成的尼替西农（nitisinone）。此外，还用到了 ABTS 和尿黑酸等作为黑色素底物前体。
3. 黑色素 “幽灵” 的分离：通过一系列复杂的步骤分离黑色素 “幽灵”，包括细胞收集、酶解、蛋白质和脂质去除、水解以及透析冻干等过程。之后对其进行元素分析，测定碳、氮、氧和氢的含量。
4. 真菌生长和色素产生的测量：通过在含有黑色素抑制剂的培养基中接种分生孢子，监测其在不同时间的吸光度来评估真菌的生长能力，使用 XTT 还原法测定真菌细胞活力。同时，通过测量不同波长下的吸光度分析黑色素的产生情况。
5. 细胞外酚氧化酶产生（漆酶活性）的测定：利用 ABTS 作为底物，通过检测其被漆酶氧化后产生的稳定阳离子自由基的浓度，来定量测定漆酶的活性，从而判断细胞外酚氧化酶的产生情况。
6. 吞噬和杀伤实验：从 C57BL/6 小鼠骨髓祖细胞中获取原代巨噬细胞，将巨噬细胞与经过处理的 L. prolificans 分生孢子以 3:1 的感染复数进行孵育，之后进行吞噬和杀伤实验，评估巨噬细胞对真菌的作用。
7. Zeta 电位测定：使用 Zeta 电位分析仪测量不同处理条件下 L. prolificans 细胞的电荷，以评估黑色素合成抑制对细胞表面电荷的影响。
8. 透射电子显微镜（TEM）观察：对 L. prolificans 黑色素颗粒进行固定、包埋、切片和染色等处理，使用透射电子显微镜观察黑色素在细胞细胞壁上的沉积情况。
9. 电子顺磁共振（EPR）分析：将黑色素 “幽灵” 颗粒悬浮在水中，超声处理后用 EPR 光谱仪检测其中的自由基含量。
10. 傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析：使用 FTIR 光谱仪对 L. prolificans 黑色素中的分子基团进行表征，通过与标准 DOPA - 黑色素光谱对比，分析其化学组成。
11. 固态核磁共振（ssNMR）分析：在特定的固态核磁共振光谱仪上对黑色素进行实验，通过分析光谱特征，研究黑色素的结构以及抑制剂对其结构的影响。
12. 统计分析：运用 GraphPad Prism 8.00 软件进行统计分析，采用单因素方差分析和 Kruskal - Wallis 非参数检验比较组间差异，使用 Bonferroni post - test 进行组间个体比较，Student’s t 检验用于比较不同组的菌落形成单位数量。

结果

1. L. prolificans 黑色素的生物学和结构特征
   • 黑色素抑制剂对细胞活力和色素沉着的影响：部分黑色素抑制剂在高剂量（高于 30μg/mL）时会显著抑制 L. prolificans 的生长和活力，且呈剂量依赖性。但在 30μg/mL 浓度下，经过 30 天培养，这些抑制剂对 L. prolificans 的生长和活力没有显著影响。高剂量的黑色素抑制剂会使 L. prolificans 细胞色素沉着和活力明显下降，甚至导致细胞无法生长。不同培养基中生长的 L. prolificans 细胞颜色不同，添加 30μg/mL 的黑色素抑制剂会改变细胞颜色，但不会完全消除颜色。
   • 酚氧化酶活性：L. prolificans 基因组中存在编码漆酶和酪氨酸酶的基因，其培养上清液在 PD 和 PDA 培养基上检测酚氧化酶活性时呈阳性，表明 L. prolificans 具有合成 DOPA - 黑色素的能力。
   • 吞噬和杀伤实验：棕色表型的 L. prolificans 分生孢子更容易被巨噬细胞吞噬，经过黑色素抑制剂处理的分生孢子对巨噬细胞的杀伤作用更敏感，说明抑制黑色素化会增加 L. prolificans 对巨噬细胞杀伤的易感性。
   • Zeta 电位分析：黑色素通常带负电荷，L. prolificans 细胞在不同处理条件下的 Zeta 电位变化表明，抑制黑色素合成会使细胞表面电荷增加，Zeta 电位向正值方向变化。
   
   
2. L. prolificans 黑色素的结构特征
   • TEM 评估黑色素在细胞壁上的沉积：TEM 图像显示，添加黑色素抑制剂后，L. prolificans 分生孢子细胞壁上的黑色素层减少，这与细胞颜色变浅的表型相关。
   • EPR 测量自由基含量：EPR 光谱显示，L. prolificans 黑色素 “幽灵” 的光谱特征与 DOPA - 黑色素相似，经过抑制剂处理后，信号强度发生变化，可能存在补偿机制。
   • FTIR 光谱鉴定化学基团：FTIR 光谱表明，L. prolificans 天然黑色素的光谱与 C. neoformans DOPA - 黑色素相似，同时还存在一些独特的吸收峰，暗示其可能是多种黑色素的混合物。
   • L. prolificans 黑色素单体单元的元素分析：元素分析显示，L. prolificans 黑色素含有 C、H、N 等元素，可能是 DHICA/DHI 和 DHN 真黑素的混合物。添加某些抑制剂会改变黑色素的元素组成，影响其化学结构。
   • 黑色素化细胞壁的¹³C 固态核磁共振分析：¹³C ssNMR 光谱显示，L. prolificans 黑色素可能包含 DHN - 和 L - DOPA 衍生的色素。不同抑制剂对黑色素的光谱特征有不同影响，进一步证明其黑色素的复杂性和合成途径的多样性。
   • 光学和 ssNMR 评估 pyomelanin 作为 L. prolificans 黑色素的可能性：添加 pyomelanin 底物 HGA 会增加色素形成，而添加其抑制剂尼替西农则会减少色素形成。¹³C ssNMR 分析表明，多种抑制剂共同作用会抑制黑色素的产生，说明 L. prolificans 可能利用多种黑色素合成途径。
   
   

讨论

L. prolificans 感染虽然目前相对罕见，但因其高死亡率和抗真菌药物耐药性，给治疗带来极大挑战。黑色素被认为与抗真菌药物耐药性有关，但之前删除 DHN - 黑色素生产相关基因的研究并未发现其对两性霉素 B 的敏感性有影响，不过增加了对氧化杀伤的敏感性。

一些相关真菌如 Scedosporium（formerly Pseudallescheria）boydii 和 Scedosporium apiospermum 会通过 DHN 途径产生黑色素，但对这些黑色素的研究较少。本研究通过多种方法对 L. prolificans 黑色素进行了全面表征，发现其黑色素的颜色和色素沉着受培养基和培养时间影响。多种黑色素抑制剂共同作用会减少黑色素的 UV 吸收，高剂量的 DHN - 黑色素和 DOPA - 黑色素抑制剂会降低细胞色素沉着和黑色素层厚度，而添加 pyomelanin 底物会增加色素形成。

元素分析支持 L. prolificans 黑色素是多种黑色素的混合物，漆酶活性的存在表明其能产生多种黑色素。Zeta 电位测量显示，抑制黑色素合成会改变黑色素结构。生物和物理测量以及结构分析都表明，L. prolificans 黑色素是真黑素和褐黑素的混合物。ssNMR 结果进一步证实，多种抑制剂共同作用才能抑制黑色素的产生，说明 L. prolificans 可以利用多种黑色素合成途径。

综上所述，本研究揭示了 L. prolificans 黑色素的多样性，它能够通过不同途径产生 DHN - 、DOPA - 和 pyomelanin 色素。然而，已知的抑制剂无法完全抑制黑色素的形成，这表明 L. prolificans 可能还会产生其他类型的黑色素，为后续研究提供了新的方向。