基于Gag-Only策略的优化型慢病毒样颗粒开发及其在基因编辑工具递送中的验证研究

基因编辑工具的递送安全性和效率是制约其临床应用的关键瓶颈。为解决传统慢病毒载体因HIV-Pol蛋白导致的基因组整合风险，中国医学科学院等团队创新性开发了仅含HIV-Gag蛋白的慢病毒样颗粒(LVLP)递送系统。通过psi包装信号与HDVrz核酶优化，成功实现PAMless腺嘌呤碱基编辑器(CE-8e-SpRY)mRNA和sgRNA的高效包载，在293T和Jurkat细胞中分别达到50%和20%的编辑效率，且靶向PD1/B2M/CIITA/TIGIT等肿瘤免疫关键基因。该研究为癌症免疫治疗提供了更安全的递送平台，发表于《European Journal of Medical Research》。

　　

基因编辑技术为遗传疾病和癌症治疗带来了革命性希望，但递送系统的安全性始终是悬在头顶的达摩克利斯之剑。传统慢病毒载体虽效率出众，却因携带HIV-Pol蛋白中的逆转录酶和整合酶，存在基因组随机插入诱发肿瘤的风险。即便采用整合缺陷型慢病毒(IDLV)，残留的整合酶活性仍可能通过非同源末端连接(NHEJ)途径造成意外插入。这种"带刀送货"的模式严重制约了CRISPR-Cas9和碱基编辑器(BE)的临床应用，特别是在需要瞬时表达的基因编辑场景中。

中国医学科学院北京协和医学院国家卫生健康委科学技术研究所的研究团队另辟蹊径，开发了一种名为"Gag-Only"的创新策略。该研究摒弃了传统的HIV-Gag/Pol双蛋白系统，仅利用HIV-Gag蛋白的自组装特性构建慢病毒样颗粒(LVLP)，从源头上消除了Pol蛋白相关的基因组整合风险。研究人员选择PD1作为概念验证靶点——这个免疫检查点分子的过度表达会抑制T细胞抗肿瘤活性，其起始密码子ATG的精准编辑有望为癌症免疫治疗开辟新途径。

研究团队采用了多管齐下的技术路线：通过化学诱导二聚体(CID)系统验证Gag-Only策略的可行性；利用MS2-MCP、PP7-PP7BP和psi-Gag三种RNA-蛋白相互作用机制优化mRNA包载效率；构建稳定表达PD1-luciferase融合蛋白的293T报告细胞系用于功能评估；采用数字PCR(ddPCR)绝对定量sgRNA拷贝数；最后通过孟德尔随机化(MR)分析筛选出B2M、CIITA和TIGIT等与癌症风险显著相关的基因作为扩展靶点。

在"Gag-Only LVLP的构建可行性"部分，透射电镜显示成功制备出100-130 nm的标准HIV样颗粒，ELISA检测p24蛋白浓度证实产量与常规系统相当。有趣的是，将FKBP结构域与HIV-Gag融合、FRB结构域与荧光素酶融合后，化学诱导形成的LVLP表现出显著高于对照的荧光素酶活性，证实了该策略的蛋白递送能力。

研究团队在"LVLP系统包载CE-8e-SpRY mRNA"环节大放异彩。针对无PAM限制的CE-8e-SpRY碱基编辑器，他们设计了两组靶向PD1 ATG密码子的sgRNA（正向sgRNA和反向FX-sgRNA）。通过比较psi、MS2和PP7三种包装策略，发现psi-LVLP的mRNA包载量最高，这归功于psi序列与Gag蛋白的高亲和力。在优化质粒比例后，psi-LVLP的碱基编辑效率从15%提升至30%，这通过PD1-293T报告细胞中荧光素酶活性的显著降低得到验证。

真正的突破出现在"HDVrz-psi-sgRNA修饰"部分。研究人员巧妙地将肝炎δ病毒核酶(HDVrz)与psi包装信号串联在sgRNA的3'端，前者确保sgRNA的精确切割，后者增强与Gag蛋白的结合。ddPCR定量显示这种设计使sgRNA拷贝数翻倍，最终在293T细胞中实现50%的编辑效率——这是迄今报道的非病毒递送系统中罕见的高效率。Western blot证实PD1蛋白表达显著下调，为癌症免疫治疗提供了直接证据。

研究的深远意义在最后章节彰显。通过孟德尔随机化分析，发现B2M（MHC I类分子）、CIITA（MHC II类分子转录激活因子）和TIGIT（新兴免疫检查点）的遗传变异与多种癌症风险显著相关。针对这些靶点设计的HDVrz-psi-LVLP在Jurkat细胞中展现出20%的编辑效率，证实了平台的多基因适配性。值得一提的是，B2M和CIITA的编辑可解决CAR-T治疗中的移植物抗宿主病(GVHD)难题，而TIGIT抑制则能增强抗肿瘤免疫应答。

这项研究在多个维度实现了突破：安全性方面，Gag-Only策略彻底规避了Pol蛋白的整合风险；效率层面，psi-HDVrz双优化系统使编辑效率媲美质粒转染；应用广度上，PAMless特性拓展了靶点选择范围。与David团队开发的含Pol蛋白的ABE8e-VLP相比，该系统的安全性显著提升；而相较于脂质纳米粒(LNP)的肝脏趋向性，LVLP在非肝组织中的递送更具优势。

当然，该平台仍需完善：全基因组测序确认无脱靶效应、大型动物模型验证、规模化生产工艺开发等都是未来研究方向。但毋庸置疑，这项发表于《European Journal of Medical Research》的工作为基因治疗领域树立了新标杆——它不仅是技术工具的革新，更体现了"以临床需求为导向"的转化医学理念，为肿瘤免疫治疗提供了兼具安全性与高效性的"智能递送"解决方案。当基因编辑技术遇上精巧的递送设计，或许我们正站在精准医学新纪元的门槛上。