编辑推荐：
本文综述了纳米孔传感技术在蛋白质和肽构象检测中的应用。随着全球人口老龄化，疾病早期诊断愈发重要，纳米孔技术可检测生物标志物（biomarker）的构象变化，有望用于超灵敏、个性化的即时护理（POC）设备，文中还探讨了其面临的挑战与前景。
纳米孔传感技术：疾病诊断的新希望
在全球人口老龄化的大背景下，慢性疾病的发病率不断上升，早期诊断成为改善医疗护理和提高患者生活质量的关键。许多疾病与生物标志物肽和蛋白质的错误折叠或构象变化密切相关，这些变化会影响它们的功能和结合特性。然而，现有的临床检测方法在检测和量化这些变化时存在困难，因此，开发能够检测生物流体中低浓度分析物的敏感构象传感器迫在眉睫。纳米孔电检测技术在检测蛋白质和肽的细微构象变化方面展现出了巨大潜力，它可以实现单分子无标记检测，同时区分形状或物理化学性质的变化，为未来的健康挑战提供了一种可能的解决方案。
背景：生物标志物变体的定量分析
蛋白质的功能受到与其他蛋白质（蛋白质 - 蛋白质相互作用，PPIs）、肽、核酸和 / 或小分子相互作用的调节，构象变化在其中起着关键作用。在许多病理状态下，这些相互作用往往会失调，构象变化的范围从单个或少数氨基酸周围的局部构象、静电或化学性质的改变，到整体构象的变化。例如，单个氨基酸的替换、对映异构化或翻译后修饰（PTM）等微小变化，都可能影响蛋白质与受体、配体或离子的结合能力，以及寡聚化、自组装和聚集的能力，进而导致生物功能异常。众多疾病都与蛋白质和肽的构象变化引起的调节异常有关，如凝血过程中的自组装异常、阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病中蛋白质的错误折叠和聚集。虽然有多种方法可以定义构象变化，但很少有方法能够满足临床定量检测的要求，在复杂生物流体中检测由单个氨基酸修饰或 PTM 状态变化引起的细微变化仍然是一个挑战。
当前生物标志物定量和构象分析的方法
- 质谱法（MS）：质谱法可用于识别潜在的生物标志物，并通过统计分析确定特定疾病的生物标志物谱。它可以通过未标记或同位素标记的方法对目标生物标志物进行定量，但该技术需要至少 106 个相同蛋白质分子才能检测到，且结果是大量分析的平均值，可能会遗漏一些罕见事件，无法区分具有相同质荷比的变体，还需要昂贵的设备、专业的操作人员和高浓度的分析物，限制了其在常规临床诊断中的应用。
- 免疫分析技术：免疫分析技术如酶联免疫吸附测定（ELISA）和荧光免疫分析，是基于亲和力结合的方法，常用于临床生物标志物的定量检测。这些方法可以使用抗体特异性地检测目标蛋白质或肽，甚至在低浓度（fM）下也能检测到。然而，免疫分析受到抗体 - 表位相互作用固有特性的限制，抗体可能无法检测到表位上不存在的一级序列变化或微小构象变化，导致交叉反应和对不同变体的误检测，还可能因表位变化而降低抗体结合效率，产生假阴性结果。
- 传统构象分析技术：传统的构象分析技术如核磁共振（NMR）、X 射线晶体学和冷冻电镜（CryoEM），对于理解蛋白质构象与功能的关系至关重要，但它们需要大量的蛋白质、高纯度的样品，且无法定义构象动力学。振动光谱技术如拉曼光谱和红外光谱，可检测生物分子的构象变化，具有非侵入性、快速准确等优点，但仪器昂贵、信号弱，需要专业操作人员和广泛的校准，且生物组织荧光会干扰测量，激光穿透深度有限，限制了其在临床中的应用。
- 单分子技术：单分子技术如单分子荧光共振能量转移（smFRET）和原子力显微镜 - 单分子力谱（AFM - SMFS），比传统的大量分析方法灵敏度高约 5 个数量级，但需要高度纯化或预处理的样品，不适合在生物流体中使用，设备昂贵，对操作人员要求高。荧光相关光谱（FCS）有潜力用于单分子生物标志物检测，但需要标记抗体，存在与 ELISA 技术类似的局限性。
纳米孔传感技术
- 技术原理：纳米孔传感是一种单分子实时电检测方法，在纳米尺度（nm 或 10 ? 尺度）下工作。纳米孔实验通过在充满离子溶液的两个腔室之间的脂质膜中插入单个蛋白质纳米孔，施加电位差后，离子通过纳米孔流向带相反电荷的电极，产生特征性的开孔电流（I0）。当分析物分子与纳米孔相互作用或穿过纳米孔时，会部分阻挡离子通过，导致测量电流下降，形成阻塞电流（Ib），每个阻塞事件还可以通过停留时间（Tt）和噪声（标准偏差，σ）进行分类。根据分析物与纳米孔相互作用产生的阻塞参数，可以对不同的分析物进行分类。
- 技术挑战与应对策略：与核酸测序相比，蛋白质和肽链具有更大的多样性，纳米孔方法需要根据目标蛋白质 / 肽分析物的性质进行调整。分子通过纳米孔的驱动力主要有电泳力（EP）和电渗流（EOF），理解和调节这些驱动力对于设计高效的纳米孔系统至关重要。对于带电分析物，EP 和 EOF 的协同或拮抗作用取决于分析物和纳米孔选择离子的电荷；对于中性或弱带电分析物，EOF 是主要驱动力。此外，通过增加分析物在纳米孔内的限制、调整纳米孔的电荷和尺寸等方法，可以提高纳米孔的灵敏度和选择性。
- 检测方法：纳米孔传感可通过多种方法表征分析物，如穿线法用于 DNA 测序、指纹法识别单个分析物分子的特征事件、分子捕获法观察分子动力学或分析物与配体或离子的相互作用。纳米孔传感器的孔径对于检测至关重要，不同尺寸的分析物需要不同孔径的纳米孔，固态纳米孔适用于检测较大的分析物，而生物纳米孔更适合检测较小的分子。
纳米孔检测的应用
- 基于尺寸的生物标志物检测：纳米孔可以通过直接或间接检测的方式区分不同大小的生物标志物。直接检测时，使用与目标分析物尺寸相似的纳米孔可增加分析物在孔内的限制，提高检测灵敏度；间接检测则通过特异性诱导目标分析物体积增加或增加带电分析物来调节驱动力，提高检测效果。例如，通过纳米孔检测与抗体和 DNA 载体结合的 MPXV A29 蛋白，以及与纳米抗体结合的 EGFR 等，展示了该技术在生物流体中检测低浓度生物标志物的潜力。
- 定量构象传感
- 实时动力学分析：纳米孔技术可以通过捕获酶或蛋白质在孔内，实时分析其构象变化。例如，通过监测配体结合引起的阻塞水平变化，可确定酶 - 底物结合或其他蛋白质结合事件的动力学相互作用参数，有助于理解疾病病理过程中酶活性或蛋白质结合的变化。研究人员利用纳米孔研究了泛素化反应、NADPH 和 NADP+ 与 DHFR - MTX 复合物的结合、蛋白质 - 蛋白质相互作用等，为疾病诊断和治疗提供了重要信息。
- 单氨基酸突变检测：纳米孔传感能够区分仅相差一个氨基酸的肽，通过分析肽在纳米孔内的阻塞水平、停留时间等参数，可以识别不同的肽底物和裂解产物。例如，研究人员利用纳米孔区分了血管紧张素及其变体、血红蛋白的不同形式、与阿尔茨海默病相关的肽等，为相关疾病的诊断提供了潜在的生物标志物检测方法。
- 翻译后修饰检测：翻译后修饰（PTM）在许多生理和病理过程中起着重要作用，纳米孔技术可以检测多种 PTM。例如，通过分析蛋白质或肽在纳米孔内的阻塞参数变化，可检测硫氧还蛋白、Tau 蛋白、α - 突触核蛋白等的磷酸化、乙酰化、糖基化等修饰状态，为癌症、神经退行性疾病等的诊断提供依据。
- 对映体检测：对映体的区分是一个具有挑战性的问题，纳米孔传感的构象敏感性为检测对映体差异提供了可能。研究人员利用工程化的纳米孔，成功区分了单个氨基酸的对映体、含有对映体氨基酸的肽等，为进一步研究对映体与疾病的关系提供了技术支持。
结论
蛋白质和肽生物标志物在临床诊断和健康管理中具有重要意义，纳米孔技术在检测这些生物标志物的构象变化方面具有显著潜力。然而，在将该技术广泛应用于生物标志物研究和临床诊断之前，仍面临诸多挑战。
- 低浓度分析物检测挑战：许多潜在的生物标志物在生物流体中浓度极低，尽管纳米孔具有单分子分辨率，但分析物与纳米孔的相互作用频率和检测时间受分析物浓度和驱动力的影响，电解质溶液的使用会进一步稀释患者样品中的分析物浓度。间接检测可以通过使用带电标签或结合伙伴增加 EP 驱动力，但需要额外的预处理步骤，且受结合伙伴的限制；直接检测可以通过增加 EOF 驱动力提高捕获效率，如改变电解质溶液的离子组成、工程化纳米孔等，还可以使用分子拥挤剂增加分析物与纳米孔的相互作用频率。
- 传感分辨率挑战：提高分析物与纳米孔的相互作用时间可以提高传感分辨率，可通过增加限制和调节 EOF 来实现，如蛋白质工程和生物正交化学的结合。使用工程化的不对称孔可以增强对 chiral 氨基酸的区分能力，同时，提高分析物传感的信噪比对于定义每个独特事件的参数至关重要，除了常用的阻塞参数，额外的形状特征和事件分类方法可以提供更详细的信息。
- 人工智能应用挑战：机器学习在从生物流体中混合的生物标志物阻塞信号背景中识别特定生物标志物方面已被证明是有用的，但使用人工智能算法的主要障碍是缺乏训练数据。建立分析物阻塞参数数据库的一个额外问题是，阻塞特征对于每个分析物 - 纳米孔对都是独特的，平行检测特定分析物的多个纳米孔变体可以增加与不同形式生物标志物相关的特定阻塞数量，随着数据库的增加，人工智能驱动的分类准确性将不断提高。
- 实际应用挑战：纳米孔检测不太可能取代现有的 POC 测试，但在一些关键领域可以显著改善健康管理，如缩短检测时间、实现早期治疗等。纳米孔设备在常规医学研究中需要稳定的平台支持，目前的纳米孔技术受脂质膜脆弱性的限制，生物流体的复杂组成也给脂质膜带来挑战，使用合成聚合物或创建混合纳米孔可能是解决这些问题的方法。此外，纳米孔技术需要与纳米流体系统和电子检测相结合，开发便携式、用户友好的设备和软件，加载预训练的人工智能算法，才能实现真正的 POC 健康管理应用。
纳米孔传感技术为蛋白质和肽生物标志物的检测提供了一种强大的工具，尽管面临挑战，但随着技术的不断发展和改进，有望在临床诊断和健康管理领域发挥重要作用。
