编辑推荐：
在基因组研究中，准确进行结构变异（SV）基因分型至关重要。研究人员开展了 “K-mer analysis of long-read alignment pileups for structural variant genotyping” 主题研究。结果显示，kanpig 在单样本基因分型一致性上达 82.1% ，远超现有工具。该研究为大规模 SV 研究提供新方法，提升研究可靠性。
在基因组研究的广阔领域中，结构变异（Structural Variant，SV）基因分型就像是一把神秘的钥匙，掌握它对于解锁生命遗传信息的奥秘起着至关重要的作用。然而，目前在这个领域却面临着诸多挑战。对于较小的突变（如单核苷酸变异 SNV 和插入缺失 indels）而言，创建全基因分型变异文件（VCF）的过程已相对成熟、高效。但当涉及到结构变异（即大于 50 碱基对的基因组改变）时，情况就变得复杂起来。当前最先进的工作流程是先对每个样本进行 SV 发现，再通过诸如 truvari 等方法合并，之后重新评估每个 SV 在所有样本中的存在与否（即基因分型）。而且现有的基因分型工具大多在单样本上进行基准测试，常用的 SV 基准（如 GIAB v0.6 基准）存在局限性，它整合了短读长和有噪声的长读长发现的变异，且定义的 Tier 1 区域排除了片段重复和复杂 SV，无法全面反映真实的 SV 情况。随着研究的深入，使用更新的长读长或全基因组组装的研究表明，SV 的数量和复杂性远超 GIAB v0.6 Tier 1 区域中发现的子集。此外，在群体中进行 SV 基因分型时，由于存在多个相邻和 / 或重叠的 SV 等位基因，评估复杂性大大增加。在这样的背景下，开展更精准、高效的 SV 基因分型研究迫在眉睫。
为了解决这些难题，来自美国贝勒医学院人类基因组测序中心（Baylor College of Medicine Human Genome Sequencing Center）等机构的研究人员展开了深入探索。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为该领域带来了新的曙光。
研究人员用到的主要关键技术方法包括：利用人类泛基因组参考联盟（HPRC）的高质量组装和 GRCh38 参考基因组，通过 dipcall v0.3 生成 SV；使用 PacBio HiFi 和牛津纳米孔技术（ONT）的长读长测序数据；运用 truvari 工具进行 SV 的比较和评估；采用 kanpig 算法进行 SV 基因分型，该算法包含构建变异图、提取比对堆积、聚类单倍型等关键步骤。
下面来详细看看研究结果：
- kanpig 算法：kanpig 算法主要包含四个关键步骤。首先，解析包含 SV 的 VCF 文件，确定彼此距离在指定阈值内的 SV “邻域”；接着，构建变异图，其中节点代表 SV，有向边连接下游非重叠的 SV；然后，从 BAM 文件中解析跨越 SV 邻域的长读长比对，生成堆积并聚类单倍型；最后，通过广度优先搜索找到变异图中得分最高的路径，以此确定基因型。该算法的创新之处在于将序列表示为 k-mer 向量（默认 k 值为 4 碱基对），通过堪培拉距离（Canberra distance）衡量序列相似性。实验表明，k-mer 向量的堪培拉相似性与传统序列相似性的皮尔逊相关系数高达 0.994，能准确测量相邻 SV 的相似性。同时，该算法通过 k-means 聚类将读取聚类为单倍型，并避免路径通过重叠变异，有效防止了单倍型产生冲突的基因型。
- 建立结构变异基因型基线：研究人员利用来自 HPRC 的高可信度组装，通过 dipcall v0.3 和 GRCh38 从 47 个遗传多样的基因组组装中创建 SV。将 HPRC HG002 SVs 与 GIAB v1.1 SVs 比较后发现，该流程生成的基线 VCF 质量较高，可用于后续测试。
- 单样本 SV 基因分型：研究人员收集了 47 个 HPRC 个体的 32x 覆盖度 PacBio HiFi 长读长数据，使用 kanpig 和其他三个长读长 SV 基因分型工具（SVJedi-graph、sniffles2、cuteSV）进行常染色体 SV 基因分型。结果显示，kanpig 的平均基因分型一致性达到 82.1% ，高于其他工具。在不同覆盖度下，kanpig 的性能也表现出色，8x 覆盖度时其性能仍高于其他工具在 32x 时的表现。此外，所有工具对缺失型 SV 的基因分型一致性高于插入型 SV，而 kanpig 在不同 SV 类型间的性能失衡最小。当考虑 SV 与串联重复（Tandem Repeats，TRs）的重叠情况时，kanpig 在 TR 内和 TR 外的基因分型一致性分别为 81.7% 和 89.0%。在有相邻变异的情况下，kanpig 的平均基因分型一致性最高，为 70.9%，而其他工具在处理此类情况时表现较差。在基因型分布方面，kanpig 的平均杂合 / 纯合（het/hom）比最接近真实情况，且参考纯合错误率和缺失率也处于合理范围。
- 单样本发现基因分型：多数生成 SV 的项目无法获取高质量组装，而是使用如 sniffles 等工具从原始读取比对中发现 SV。研究人员使用 sniffles 在 47 个 HPRC 32x 样本上发现 SV 并进行基因分型测试，与基于组装的 SV 集比较。结果表明，kanpig 的基因型一致性平均为 85.0% ，高于其他工具。同时，kanpig 在处理发现的变异时，能有效去除更多的假阳性变异，同时保持较高的真阳性率。
- 多样本 SV 基因分型：为测试 kanpig 处理多样本 VCF 的能力，研究人员合并了 47 个 HPRC 样本的 sniffles 发现变异，并使用 truvari 进行处理。结果显示，kanpig 在多样本 SV 基因分型中的基因型一致性最高，达到 84.9%，在处理组装衍生的多样本 SV 时，基因型一致性也高达 86.6% ，远高于其他工具。此外，kanpig 在多样本 SV 基因分型中的精度较高，能有效避免其他工具出现的冲突基因型问题。
- 纳米孔 R9/R10 测序性能：研究人员使用公开可用的 R9 和 R10 重复样本测试 kanpig 对 ONT reads 的利用能力和读长准确性对基因分型的影响。结果发现，kanpig 在 R9 和 R10 reads 上的基因分型一致性分别为 77.8% 和 80.1%。与其他工具相比，kanpig 对读长碱基准确性的依赖性更强。在基因型一致性方面，SVJedi 在多次重复中表现最稳定，kanpig 次之。
- 计算性能：kanpig 用 Rust 编写，具有高速度和内存安全性，遵循开源 MIT 许可证。在计算性能测试中，kanpig 在处理单样本和多样本 VCF 时，无论是在单核心还是多核心情况下，都表现出较快的速度和较低的内存消耗。
在研究结论和讨论部分，研究人员详细介绍并评估了 kanpig 这一长读长 SV 基因分型工具。通过多方面的测试和比较，证明了 kanpig 在基因分型准确性上优于其他工具，尤其是在处理相邻 SV 时表现出色。同时，研究也指出理想的 SV 基因分型方法不应只追求最大化样本中 SV 的数量，而应准确处理相邻 SV，避免产生生物学上不合理的单倍型。此外，研究还强调了基准测试数据集的重要性，更复杂、全面的基准（如 GIAB v1.1 SVs 和 HPRC assemblies）有助于评估工具的真实性能。虽然 kanpig 目前表现优异，但仍有改进空间，如优化 BAM/CRAM 访问模式、利用单倍型标记读取、处理更大的 SV 等。
总的来说，这项研究成果为大规模 SV 研究提供了可靠的工具和方法，有望推动生物学和临床研究取得新突破，提高群体 SV 研究结果的可靠性，让我们对基因组结构变异有更深入、准确的认识，为未来精准医学的发展奠定了坚实基础。
