探秘新冠病毒主蛋白酶耐药与补偿机制：E166 与 L50 的 “暗涌博弈”

新冠病毒主蛋白酶（Mpro）是治疗 COVID-19 的关键靶点。本文研究了 E166A、E166V 突变及与 L50F 联合突变对药物耐药性的影响，解析了相关分子机制，为设计抗耐药性抑制剂提供了重要依据，助力抗击新冠病毒。

　　

引言

新冠病毒主蛋白酶（M^pro）对病毒复制至关重要，是 COVID-19 抗病毒药物研发的主要靶点。Paxlovid 中的 nirmatrelvir（PF-07321332）可抑制 M^pro，但体外研究发现 M^pro出现耐药突变。E166 位点虽在冠状病毒中高度保守，却易发生耐药突变，影响 nirmatrelvir 效力。E166A、E166V 等突变会导致酶活性降低，不过 L50F 突变可能补偿这种活性损失，二者联合突变对当前抗病毒药物构成威胁。因此，研究这些突变的分子机制，对设计有效抗病毒药物意义重大。

结果

1. nirmatrelvir 和 PF-00835231 对 E166A 和 E166V M^pro变体效力降低：研究构建了 L50F、E166A、E166V、E166A/L50F 和 E166V/L50F 这 5 种 M^pro变体。通过荧光酶法测定 nirmatrelvir 和 PF-00835231 对各变体的效力，发现 E166A 变体对 nirmatrelvir 有中度耐药，效力损失约 30 倍；E166V 变体耐药严重，效力降低 2700 倍。L50F 突变加入单突变体后，可部分恢复药物效力。相比之下，各变体对 PF-00835231 的效力变化较小，最多降低 10 倍。
2. E166 变体酶活性显著降低，L50F 具有补偿作用：检测 E166A、E166V、E166A/L50F 和 E166V/L50F 变体切割天然 nsp4 - nsp5 裂解位点对应肽段的效率，发现所有变体的催化效率（k_cat/K_M）均大幅下降，不到野生型（WT）的 40%，主要是由于k_cat降低。L50F 单独存在时具有高活性，其催化效率为 WT 的 133%。L50F 与 E166 变体联合时，能部分恢复酶活性，如 E166V/L50F 变体的催化活性比 E166V 单变体提高 185%，E166A/L50F 变体比 E166A 单变体提高 255%。
3. E166 变体二聚化缺陷但热稳定性与 WT 相似：利用原生质谱（nMS）检测无配体时 M^pro的二聚化情况，发现 WT M^pro在 5 μM 时 90% 二聚化，而所有 E166 变体及 L50F 单变体的二聚化程度均显著降低。通过差示扫描荧光法评估热稳定性，结果显示无抑制剂时，E166 变体热稳定性与 WT 相近；有抑制剂时，E166 变体热稳定性低于 WT，且对 nirmatrelvir 耐药性越强，热稳定性降低越明显，而对 PF-00835231 耐药性相似的变体热稳定性相近，L50F 单变体与 PF-00835231 结合时热稳定性与 WT 相似。
4. E166 M^pro变体晶体结构揭示 N 端的替代构象：解析了 SARS-CoV-2 M^pro E166A、E166V 和 E166V/L50F 变体与 PF-00835231 的共晶结构。在 WT M^pro中，Glu166 形成三个关键氢键来完成 S1 口袋，但在 E166 变体中这些氢键均不存在。同时，E166 变体的 N 端构象发生改变，倾向于抑制剂的 β- 内酰胺环，部分替代 Glu166 的作用。不同变体的 N 端构象存在差异，有的单体 N 端有序，有的无序或呈替代构象。

讨论

本研究表明，SARS-CoV-2 M^pro的 E166 突变会降低 nirmatrelvir 和 PF-00835231 的效力，同时损害催化效率。L50F 突变可补偿耐药 M^pro变体的酶活性损失，其在冠状病毒进化中具有变异性，可能是病毒应对抗病毒压力的适应性途径。E166 突变特异性破坏抑制剂结合，却对底物结合影响较小，PF-00835231 因结构相对灵活，对 E166 突变的耐受性更强。结构水在耐药变体活性位点可能起关键作用，可部分替代 E166 的功能。E166 是新冠病毒耐药研究的关键位点，其突变虽降低催化效率，但 L50F 等补偿突变使耐药情况更复杂。了解病毒的适应性机制，有助于设计对抗耐药和补偿的抑制剂，应对当前和未来的冠状病毒威胁。

材料和方法

1. 蛋白质纯化：野生型和变体 M^pro蛋白带有 N 端多组氨酸 - SUMO 标签，通过定点突变将点突变引入 pETite 表达质粒，再按先前方法进行表达和纯化。
2. 结晶：将 6 mg/mL 的各 M^pro与 10 倍摩尔过量的 PF-00835231 在室温孵育 1 小时形成复合物，离心去除不溶性物质和蛋白聚集体。采用悬滴气相扩散法，在含有 10%-20%（wt/vol）PEG 3350、0.2 M NaCl 和 0.1 M Bis-Tris methane（pH 5.5）的溶液中，于室温在预涂油的 VDX 托盘中结晶，调整蛋白与母液比例可获得大的衍射质量晶体。
3. 数据收集和结构测定：晶体在布鲁克海文国家实验室 NSLS-II 光束线 17-ID-2（FMX）收集数据，收集前将晶体浸泡在含 25% 甘油的低温溶液中，然后在液氮中冷冻。使用 XDS 对衍射强度进行自动索引、积分和缩放，利用 PHASER 进行分子置换，参考模型为 PDB ID: 8DSU，保留 5% 数据计算R_free。在拟合抑制剂原子前，用 Gaussview 6 和 Gaussian 16 优化抑制剂几何结构，使用 Coot 和 Phenix 进行模型构建和精修。
4. 结构分析：共晶结构中不对称单元包含一个 M^pro二聚体，利用 PyMOL 进行结构分析和图形生成，通过 show_contacts 插件确定氢键。
5. 差示扫描荧光法：在含或不含抑制剂的条件下，以 2 μM M^pro、50 mM Tris（pH 8.0）、300 mM NaCl 和 2% DMSO 为反应体系，加入 5× Sypro orange 染料进行热位移实验。根据对最耐药变体的效力确定抑制剂浓度，确保所有蛋白酶变体完全饱和。孵育后加入染料，在 Bio-Rad CFX 实时 PCR 热循环仪中进行热变性实验，通过 Boltzmann sigmoidal 模型拟合数据计算熔点温度（T_m）。
6. 酶活性测定：将 75 - 500 nM 的酶加入含 0 - 200 μM FRET 底物的测定缓冲液中，在室温下用 PerkinElmer EnVision 酶标仪监测裂解反应，激发波长 340 nm，发射波长 492 nm。每个变体进行三次或更多重复实验，根据 Michaelis - Menten 方程拟合初始速度与底物浓度的关系，计算酶动力学参数。
7. 酶抑制测定：在测定缓冲液（含 1% DMSO）中进行抑制实验，将酶与不同浓度的 nirmatrelvir 或 PF-00835231 在室温孵育 1 小时，加入 40 μM 蛋白酶 FRET 底物启动反应，用 PerkinElmer EnVision 酶标仪监测。至少进行三次重复实验，根据 Morrison 方程计算抑制常数（K_i）。
8. 原生质谱：将蛋白在 SEC 缓冲液中纯化，透析至 200 mM 醋酸铵（pH 6.8），调整浓度至 5 μM。使用 QE-UHMR 质谱仪进行原生质谱分析，参数设置为正离子模式、喷雾电压 1.5 kV、分辨率 12,500、质荷比范围 2,000 - 8,000，使用 PMI-Byos Intact 软件分析质谱图，每个蛋白分析三次。