揭秘蓝藻中无辅因子磷酸甘油酸变位酶（iPGAM）的调控奥秘：为生物技术开辟新路径

本文聚焦蓝藻无辅因子磷酸甘油酸变位酶（iPGAM），研究其受 PII - 相互作用调节因子 PirC 调控机制。发现蓝藻 iPGAM 独特结构，明确其对调控及碳通量的影响，为构建生物技术底盘提供新思路，对蓝藻碳代谢研究意义重大。

　　

引言

磷酸甘油酸变位酶（PGAMs）广泛存在于生物体内，连接多种糖代谢途径，可将 3 - 磷酸甘油酸（3 - PGA）转化为 2 - 磷酸甘油酸（2 - PGA），促进碳通量进入合成代谢途径。PGAMs 分为依赖 2,3 - 二磷酸甘油酸（2,3 - BPG）的 dPGAM 和不依赖 2,3 - BPG 的 iPGAM。iPGAM 在底物结合时，通过两步反应实现甘油酸核心磷酸基团的可逆转移，反应需两个锰离子参与，且高度依赖 pH。

在蓝藻中，iPGAM 具有独特调控作用，尤其在应对氮饥饿时。以集胞藻（Synechocystis）为例，其有两个基因（slr1124 和 slr1945）编码 iPGAM，其中 slr1945 产物在适应氮限制期的碳储存聚合物生物合成中起关键作用 。在氮限制引发的黄化过程中，蓝藻细胞会降解色素、积累糖原，部分还会积累聚羟基丁酸酯（PHB）。

P_II信号转导蛋白在蓝藻适应氮限制中至关重要，它能感知细胞内能量和碳氮状态，通过与多种酶和蛋白相互作用影响细胞机制。PirC 是新发现的与 P_II相互作用的蛋白，在氮充足时，P_II与 PirC 结合，阻止 iPGAM 被抑制；氮限制时，PirC 与 P_II解离，进而抑制 iPGAM，影响碳代谢途径 。由于蓝藻 iPGAM 的调控方式独特，研究人员推测其具有特殊结构特征，故开展本研究，以明确蓝藻 iPGAM 中特定结构在调控及与 PirC 相互作用中的作用。

结果

1. 计算机分析揭示蓝藻 iPGAM 的独特亚结构域：通过对 338 种不同 iPGAM 进行多序列比对和系统发育分析，发现蓝藻和红藻的 iPGAM 单系进化，与其他物种不同。蓝藻 iPGAM 有两个独特序列片段，一个是靠近末端的 17 个氨基酸的内部片段，另一个是延伸的 C 末端（CT）。内部片段氨基酸序列高度保守，常以 EGE 开头，CT 片段除特定位置的精氨酸和脯氨酸外，序列保守性差。借助 SWISS - MODEL 和 AlphaFold 服务器预测集胞藻 iPGAM（Slr1945）结构，显示其具有 iPGAM 典型的磷酸酶和转移酶亚结构域。AlphaFold 预测未结合底物时呈开放结构，SWISS - MODEL 预测结合底物时为封闭结构，二者都揭示了蓝藻特有的环结构，AlphaFold 还预测出延伸的 CT 为随机卷曲，且与环结构局部接近。
2. 质量光度法表明 iPGAM 与三个 PirC 单体相互作用：在大肠杆菌中表达并纯化重组带标签的 iPGAM 和 PirC 蛋白，经质量光度法分析，单体 iPGAM 质量为 73 - 88kDa，PirC 为六聚体，质量在 100 - 114kDa，还有更高寡聚体。iPGAM - PirC 复合物最大峰为 125kDa 左右，比 iPGAM 单体大 55 - 65kDa，符合结合三个 PirC 单体的大小，推测复合物由一个 iPGAM 单体和三个 PirC 亚基组成，但 AlphaFold 无法准确预测该复合物结构，仅能较可靠地预测结合一个 PirC 的复合物。
3. 无亚结构变体改变 PirC 结合和抑制特性：构建三种集胞藻 iPGAM 变体（iPGAM - Δloop、iPGAM - ΔCT、iPGAM - ΔloopΔCT），通过下拉分析发现它们都能与 PirC 相互作用。生物层干涉术（BLI）测量显示，删除环、CT 片段或两者都会增强与 PirC 的亲和力，iPGAM - Δloop 和 iPGAM - ΔloopΔCT 的解离常数（K_D）比野生型（WT）降低一半，iPGAM - ΔCT 的 K_D降低四倍。酶活性测定表明，删除环使 iPGAM 活性降至 WT 的三分之一，且对 PirC 抑制的敏感性降低；删除 CT 使 iPGAM 催化效率大幅提高，PirC 对其抑制作用几乎消失；双突变体 iPGAM - ΔloopΔCT 兼具两者特性 。
4. 无亚结构域变体影响黄化过程中的生理特性：构建 iPGAM 变体突变株，在氮充足条件下，各变体株与 WT 生长相似；氮缺乏时，ΔPirC 菌株无法完成细胞分裂使光密度（OD₇₅₀）加倍，而 iPGAM 变体株可以。iPGAM - ΔCT 和 iPGAM - ΔloopΔCT 菌株积累的 PHB 水平与 ΔPirC 菌株相似，iPGAM - Δloop 菌株与 WT 相似，且各 iPGAM 变体株在氮饥饿时糖原积累和降解情况也有所不同。

讨论

本研究揭示了 iPGAM 在蓝藻碳通量调节中的关键作用。蓝藻 iPGAM 的两个结构元件与 PirC 存在独特功能联系，其系统发育分析显示与其他物种 iPGAM 差异显著。iPGAM 受 PirC 抑制表现出竞争和非竞争抑制特征，PirC 可能阻碍酶反应所需的结构域闭合。删除环结构降低 iPGAM 活性和对锰离子的亲和力，而删除 CT 结构则提高 iPGAM 活性，削弱 PirC 的抑制作用。

在氮充足时，各 iPGAM 变体株生长正常，说明其虽有活性差异，但仍能维持代谢平衡；氮饥饿时，iPGAM 变体株与 ΔPirC 菌株表现不同，iPGAM - ΔCT 和 iPGAM - ΔloopΔCT 菌株在积累 PHB 的同时，还能像 WT 一样响应氮饥饿，积累糖原并进行最后一次细胞分裂，而 ΔPirC 菌株则立即进入生长停滞。这表明 PirC 除抑制 iPGAM 外，可能还有其他作用，但对 PHB 积累而言，抑制 iPGAM 似乎是其最重要的功能。与 ΔPirC 菌株相比，iPGAM - ΔCT 和 iPGAM - ΔloopΔCT 菌株在生物技术应用中具有优势，因其在氮饥饿时不会出现生物量损失。未来需进一步解析 PirC - iPGAM 复合物的实际结构，以明确其抑制机制的细节 。