STAT3 信号通路：调控小鼠胚胎发育的关键 “密码”，对人类健康研究意义重大

本文研究发现 STAT3 基因敲除的小鼠胚胎发育迟缓，丝氨酸 727 磷酸化的 STAT3（pS727-STAT3）在胚胎发育中起重要作用。该研究揭示了 STAT3 在胚胎发育进程中的调控机制，为理解胚胎发育和相关疾病的发生提供了新视角，对生命科学研究意义重大。

　　

STAT3 信号增强小鼠胚胎植入后的组织扩张

信号转导及转录激活因子 3（STAT3）信号通路在小鼠胚胎干细胞研究中备受关注。研究发现，STAT3 基因敲除的胚胎虽能植入子宫，但此后发育出现延迟，这种延迟现象一直持续到胚胎发育中期之后。在胚胎植入后的外胚层扩张阶段，丝氨酸 727 磷酸化的 STAT3（pS727-STAT3）占据主导地位。将 STAT3 基因敲除的胚胎干细胞（ESCs）注射到嵌合胚胎中，其衍生细胞会被排除在血细胞谱系之外。并且在体外实验中，野生型（WT）细胞在原始红细胞分化过程中会胜过 STAT3 基因敲除的 ESCs。这些结果表明，STAT3 在胚胎发育进程的时间控制中发挥作用，尤其是在需要快速细胞分裂的组织，如植入后的外胚层和造血谱系中。有趣的是，人类 STAT3 基因突变与身材矮小有关。

研究结果

1. STAT3 对器官发生并非必需，但维持发育节奏至关重要：此前研究表明，缺乏 Stat3 的小鼠胚胎在胚胎滞育时，其内部细胞团（ICM）成分会迅速丢失，这意味着 STAT3 信号通路对于植入前状态下外胚层和原始内胚层（PrE）的长期存活是必需的。在本次研究中，对未经历滞育的胚胎进行研究，这些胚胎由 Stat3 杂合（het）小鼠在 CD1 遗传背景下杂交产生。通过免疫荧光（IF）技术对植入前胚胎期（E）4.5 天的 Stat3 基因敲除（n = 4）与 WT 或 het 胚胎（n = 17）进行检测，以 NANOG 作为外胚层标记，GATA6 作为 PrE 标记。结果发现，Stat3 基因敲除的胚胎中 NANOG 阳性细胞数量显著减少，而 GATA6 阳性细胞的平均数量在不同基因型之间没有明显差异。同时，突变胚胎中滋养外胚层（TE）细胞的平均数量相比 WT 或 het 小鼠明显减少。这一现象可能是由于较小的基因敲除外胚层导致成纤维细胞生长因子（FGF）信号减少，暗示 FGF4 在滋养外胚层增殖中具有重要作用。令人惊讶的是，在 CD1 遗传背景下，Stat3 基因敲除的胚胎可以存活到 E11.5，但与同窝幼崽相比，其形态更接近前一天的发育阶段，且没有其他明显的形态缺陷。这表明缺乏 STAT3 的胚胎在植入后，外胚层内无法启动足够的细胞分裂，而这种细胞分裂对于胚胎发育早期的大小调节机制至关重要。
2. STAT3 基因敲除外胚层遵循正常但延迟的发育轨迹：从 CD1 遗传背景的 Stat3 杂合小鼠交配产生的胚胎中，在 E5.5、E6.5 和 E7.5 解剖外胚层，这涵盖了外胚层从幼稚状态，经过中间的形成阶段，到启动多能性以及原肠胚形成开始的发育过程。对每个胚胎进行基因分型，并对分离的外胚层进行批量 RNA 测序，以比较 Stat3 野生型和基因敲除外胚层的转录谱。结果显示，E5.5 时，野生型和基因敲除样本的转录特征非常相似，但 E6.5 时，基因敲除外胚层明显滞后，其表达模式介于野生型 E5.5 和 E6.5 之间。到了 E7.5，基因敲除外胚层与野生型 E6.5 的聚类更紧密。基因敲除外胚层在 E6.5 时，幼稚多能性基因下调，启动多能性基因上调，这与体内原肠胚形成的准备过程一致。然而，在 E7.5 时，突变体未能显著诱导神经外胚层的形成，且选定的原条基因表达降低，这与原肠胚形成的时间延迟相符。
3. STAT3 在早期植入后胚胎中的活性由 pS727 主导：利用针对 STAT3 两种磷酸化形式（pY705 和 pS727）的验证抗体，对 WT CD1 小鼠胚胎从植入到原肠胚形成的过程进行 IF 研究。结果显示，在植入前胚胎（E4.5）中可检测到核 pY705 STAT3，但在植入后不久，除了胚胎外脏层内胚层，pY705 在 WT 胚胎中几乎检测不到，直到原肠胚形成中后期，它才在原条的节点区域重新出现。而 pS727 在 E4.5 - E6.5 期间，在外胚层、胚胎外外胚层和胚胎外内胚层中都很丰富，到 E7.5 时，其分布局限于脏层内胚层、外胚层及其衍生物。这些阶段与胚胎在原肠胚形成期间对线粒体功能的需求增加相吻合，因为此时需要快速细胞分裂来实现组织扩张。为了确定 pS727 激活的潜在信号通路，在体外对 WT ESCs 应用候选抑制剂测试磷酸化反应。结果发现，MEK 抑制剂 PD0325901（PD03）在无血清培养基中阻断 FGF 信号，对 Y705 或 S727 的磷酸化没有显著影响，而 JAK 抑制可消除 Y705 磷酸化，但仅部分抑制 pS727，这表明 S727 可以由 JAK 信号或 LIF - gp130 受体下游或不同的因子磷酸化。
4. 可从 STAT3 基因敲除的植入后外胚层中获得自我更新的干细胞系：ESCs 在激活素 A 和 FGF2 存在的情况下培养 48 小时，可分化为形成外胚层样细胞（EpiLCs）。在这种条件下，Stat3 基因敲除的 ESCs 形成的 EpiLCs 与 WT 的无法区分，但从 2i/LIF 培养分化而来的 Stat3 基因敲除的 EpiLCs 增殖明显受损。有趣的是，尽管 E6.5 和 E7.5 的 Stat3 基因敲除胚胎的外胚层比 WT 同窝幼崽小，但可以高效地分离并直接作为外胚层干细胞（EpiSC）系进行培养。这些 EpiSC 系在培养中的形态和生长动力学与 WT 相似，转录谱也通过批量 RNA - seq 显示出紧密聚类。这表明在获取中胚层前条身份的体外适应过程中，STAT3 信号通路对于维持启动多能性细胞并非必需，这可能归因于 EpiSCs 在培养中的相对较慢的细胞倍增时间（约 36 小时），而体内原条形成前的外胚层细胞倍增时间约为 4 - 5 小时。
5. Stat3 基因敲除的 ESCs 在中期妊娠嵌合胚胎中被特异性排除在红细胞谱系之外：之前研究表明，Stat3 基因敲除的 ESCs 注射到囊胚中可参与所有胚胎谱系，但未进行单细胞分辨率分析以确定细胞类型特异性贡献。在本研究中，为避免供体和宿主遗传背景差异带来的影响，将荧光标记的 CD1 Stat3 基因敲除的 ESCs 注射到来自相同育种群体的 WT 宿主囊胚中，并进行单细胞嵌合测序（scChimera - seq）。结果显示，Stat3 基因敲除的 ESCs 对 E9.5 嵌合胚胎有较高贡献，验证了实验方法的有效性。在 E7.5、E8.5 和 E9.5 解剖胚胎，选择供体细胞贡献约 30% - 40% 的胚胎进行分析。通过标签转移对单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）数据进行细胞类型注释，发现 Stat3 基因敲除的细胞在 E8.5 之前对嵌合体的总体贡献在单细胞转录水平上正常。但在 E9.5 时，其在红细胞谱系中的比例明显不足。对红细胞分化轨迹进行伪时间分析，证实了 Stat3 基因敲除的细胞在从 E8.5 到 E9.5 的转变中对该谱系的贡献显著减少。差异基因表达分析显示，在红细胞伪时间过程中，经典的 Stat3 靶基因如 Cish 和 Pim1 表达失调，且 Stat5a 表达未能上调。此外，参与线粒体能量合成的 Acss1 和 Lyrm7 在 Stat3 基因敲除的红细胞中的表达降低，这可能解释了其在这个通常快速增殖的谱系中贡献受限的原因。
6. 与 WT 细胞共培养时，Stat3 基因敲除的 ESCs 向原始红细胞分化受到阻碍：为进一步研究 Stat3 基因敲除的细胞向造血和原始红细胞谱系分化的潜力，应用一种体外分化方案，该方案通过在胚胎体（EBs）中添加细胞因子诱导卵黄囊样造血和内皮祖细胞。当单独培养时，Stat3 基因敲除的 ESCs 在分化过程中的增殖与 WT 相当，直到第 8 天。在第 5 天，通过流式细胞术分析发现，Stat3 基因敲除的 ESCs 与 WT 细胞分化为血血管中胚层的能力没有区别，且两者向原始红细胞和造血祖细胞分化的效率也相同。然而，当将 Stat3 基因敲除的 ESCs 与 WT 细胞混合进行造血谱系分化时，从第 2 天开始，随着 EBs 进入中胚层和造血分化阶段，Stat3 基因敲除的细胞逐渐被排除。尽管在第 5 天，Stat3 基因敲除的细胞仍能分化为 Flk1^hi/Pdgfra^–血血管中胚层，但无法形成 Ter119⁺/CD71^hi原始红细胞。这与在嵌合胚胎中观察到的 Stat3 基因敲除的细胞被排除在扩张的红细胞谱系之外的结果一致。

讨论

1. 胚胎发育中细胞数量及发育延迟的原因：在 CD1 遗传背景下，Stat3 基因敲除的植入前小鼠胚胎与 WT 胚胎相比，外胚层细胞数量显著减少，而 PrE 细胞数量在两种基因型之间相对一致。这可能是由于之前观察到的 Stat3 基因敲除的 ICM 在中囊胚阶段 PrE 标记物（如 Pdgfra、Sox17 和 Gata4）的早熟表达，破坏了正常的谱系平衡机制。此外，Stat3 基因敲除的胚胎在植入后能够继续发育，可能依赖于卵母细胞中持续存在的母源表达的 STAT3，但它们似乎缺乏在原肠胚形成开始时进行代偿性增殖的调节机制，这可能导致胚胎发育延迟。如果外胚层细胞数量未能达到所需阈值（之前研究表明至少为 4 个），可能会产生致命后果，这也解释了为什么在 het 杂交中会出现相对较高比例的空蜕膜以及回收的 Stat3 基因敲除的植入后胚胎比例低于孟德尔比例。
2. STAT3 在胚胎发育进程中的作用差异：研究观察到，合子中删除 Stat3 的突变植入后胚胎存在持续约 1 天的发育延迟，这与之前报道的 STAT3 信号通路在妊娠后期和出生后生长中的大小调节作用相似。然而，之前在 C57BL/6 遗传背景下对 STAT3 在小鼠发育中的研究发现，Stat3 基因敲除的胚胎在 E6.5 - E7.5 期间会迅速退化。这种表型差异可能是由于不同小鼠品系中 STAT3 信号水平的差异导致的。在本研究中，Stat3 基因敲除的胚胎在其他方面似乎正常，这表明外胚层从幼稚到启动多能性的转变以及胎儿的后续模式形成可以在没有 STAT3 信号的情况下进行。这一结论与 EpiSCs 的培养特性相符，即 EpiSCs 的增殖不需要 LIF 补充，但强制激活 STAT3 或给予 LIF 可以将 EpiSCs 转化为类似 ESCs 的状态。
3. pS727 - STAT3 在胚胎发育中的作用及机制：研究数据显示，在 WT 胚胎从植入到器官发生的过程中，pY705 STAT3 蛋白含量极低，而 pS727 在此期间持续磷酸化。这与之前的报道一致，即 pS727 在体外血清存在的情况下对多能性的退出是必需的。由于 pS727 被认为是线粒体定位的 STAT3 形式，因此 Stat3 基因敲除的胚胎生长减少可能是线粒体功能下降的结果。批量 RNA - seq 也证实了 Stat3 基因敲除的外胚层与 WT 外胚层相比发育延迟约 1 天，但两者遵循相同的发育轨迹。
4. Stat3 基因敲除细胞在嵌合体中的表现及机制：将 Stat3 基因敲除的 ESCs 注射到 WT 囊胚中，其在中期妊娠前可参与所有组织，但在红细胞谱系中被排除。这是因为红细胞谱系是此阶段第一个需要快速扩张以支持胚胎生长和存活的组织。在嵌合体中，大多数 Stat3 基因敲除的胚胎谱系可能至少部分由覆盖的 WT 胚胎外组织支持，因为完整的 Stat3 基因敲除的卵圆柱体中胚胎外内胚层的前内脏内胚层（AVE）标记物 CER1 和 FOXA2 表达减少。体内嵌合体数据和体外 EB 分化研究都表明，Stat3 基因敲除的细胞在与 WT 细胞竞争时，在快速增殖的谱系中会被淘汰。已知 STAT3 通过促红细胞生成素（EPO）参与小鼠和斑马鱼的原始红细胞生成，在嵌合胚胎中，Stat3 基因敲除的细胞中 Stat5a 表达显著降低，这表明 WT 和 Stat3 基因敲除的细胞之间可能存在对 EPO 信号的竞争，STAT3 可能通过微调 EPO - STAT5 信号通路来调节原始红细胞生成。
5. 研究对人类健康的启示：STAT3 信号通路的突变与人类多种缺陷有关，包括身材矮小、自身免疫和红细胞生成缺陷等，这些缺陷在出生时被诊断出并持续到成年。许多突变是点突变，通常导致功能获得性效应，可能会破坏 STAT3 的正常功能。本研究发现小鼠胚胎缺乏 STAT3 会导致发育延迟，这支持了人类出生后生长缺陷可能始于早期植入后发育的假设，为研究相关疾病的发病机制提供了新的模型和思路。

研究的局限性

1. 基因表达差异分析的困难：研究发现小鼠胚胎缺乏 STAT3 会导致约 1 天的发育延迟，RNA - seq 分析在转录水平上证实了这一发育迟缓。然而，这种表型使得难以确定哪些基因表达差异是由 STAT3 缺失特异性引起的。此外，之前对 pSTAT3 (Y705) 在细胞系中的研究确定的 STAT3 靶基因，在本研究的胚胎 IF 研究中发现其在植入后的外胚层中并不存在，这进一步增加了分析的难度。
2. 样本的变异性：在小鼠胚胎中，即使在同一窝中，不同胚胎之间的发育阶段也存在一定差异，虽然通常不会达到 1 天的差异。雄性和雌性胚胎发育速度的差异以及自然的窝内和窝间偏差可能导致样本间的变异性，这可能影响研究结果的准确性。
3. 样本数量和胚胎发育限制：Stat3 基因敲除在发育中的胚胎中与出生或出生后发育不相容，这可能是由于晚期发育缺陷或受较大的相邻同窝幼崽的挤压。此外，Stat3 基因敲除的胚胎样本数量相对较少，且部分样本与过量的 het/WT 胚胎相比体积较小，这可能会影响研究结论的普遍性。
4. 干细胞系的局限性：从胚胎中获得的干细胞系为许多研究提供了有用的资源，但在其衍生和扩增过程中，会发生一些表型和分子变化，其细胞分裂速度通常会降低，这可能导致它们与原始组织存在一些差异，从而影响对胚胎发育相关机制的准确研究。