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为解决生物系统研究中空间和时间分辨率难以兼顾，以及 ImFCS 技术受衍射限制的问题，研究人员开展了将计算超分辨率显微镜（CSRM）技术与 ImFCS 结合的研究。结果表明 SRRF 等算法可有效提升 ImFCS 数据分析效果，这为亚细胞结构研究提供了新方法。
在生命科学的微观研究领域，探索生物系统的结构与动态变化就像一场神秘的解谜之旅。长久以来，科学家们面临着一个棘手的难题：空间分辨率和时间分辨率仿佛两个相互制约的 “小恶魔”。想要获取高空间分辨率，就得花费较长时间收集足够的光子来精准定位和描绘结构细节；而聚焦于时间动态研究时，又需要短时间内捕捉快速的分子事件，这就导致每帧收集的光子变少，信噪比降低，空间精度也大打折扣。特别是在活细胞成像研究中，这种权衡关系给研究带来了极大的阻碍。
荧光相关光谱（FCS）技术的出现，为研究分子动态提供了有力的工具。它能检测单分子事件，灵敏度和时间分辨率都很高。当 FCS 与总内反射荧光显微镜（TIRFM）及快速灵敏的相机结合，成像荧光相关光谱（ImFCS）技术诞生了。ImFCS 可以在整个照明平面捕获荧光强度，并通过关联像素随时间的波动，生成扩散系数和粒子数的空间分辨图，在研究异质和动态环境方面大显身手。然而，TIRFM 采集的数据虽然信噪比高，但却受到衍射极限的限制，侧向分辨率只有约 200nm。这一限制在研究膜近端肌动蛋白纤维时尤为突出，因为肌动蛋白纤维的横截面仅约 7nm，在 TIRF 图像中，由于衍射，所谓的 “纤维上” 区域实际上混合了来自纤维和非纤维区域的信号，这使得准确量化纤维相关的扩散动力学变得困难重重。
为了突破这些困境，新加坡国立大学的研究人员 Shambhavi Pandey、Nithin Pathoor 和 Thorsten Wohland 开展了一项极具意义的研究。他们将计算超分辨率显微镜（CSRM）技术与 ImFCS 相结合，旨在实现对亚细胞结构的高分辨率空间和动态表征。该研究成果发表在《Biophysical Journal》上，为生命科学研究开辟了新的道路。
研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。首先，通过细胞培养、转染等操作，获得表达 F - tractin - mApple 和 PMT - mApple - F - tractin 的 CHO - K1 细胞。接着利用 TIRF 显微镜，在特定条件下采集细胞图像数据。然后，使用 ImFCS 软件进行数据分析，计算扩散系数。同时，运用多种 CSRM 技术，包括超分辨率径向波动（SRRF）、均值漂移超分辨率（MSSR）、多重信号分类成像（MUSICAL）等，对 TIRF 图像进行超分辨率重建，以提高空间分辨率。
研究结果
- CSRM 技术性能评估与强度 - 动力学相关性：研究人员对比了 7 种 CSRM 技术对肌动蛋白纤维图像的重建效果。结果显示，所有 CSRM 方法都比 TIRF 图像提高了纤维分辨率，但各有优劣。ESI 将纤维重建为单一亮带，在区分较暗纤维时表现较差；MUSICAL 出现像素化和不连续的纤维重建；RL 和 DPR 的纤维分辨率相似，能保持纤维连续性；SRRF 在分辨束状纤维方面表现出色，但可能遗漏低信号纤维；eSRRF 重建分辨率下降且有明显伪影；MSSR 定位纤维不如 SRRF 精确，但对比度高。此外，研究还发现 F - tractin 在纤维丰富区域移动较慢，在非纤维区域移动较快，其动力学与纤维强度呈负相关。
- 结构掩模识别纤维区域并表征纤维特异性动力学：研究人员通过结合 TIRF 和 CSRM 生成的二元掩模，得到三元结构掩模，将感兴趣区域分为非纤维、混合和纤维上像素区域。不同 CSRM 技术在识别这些区域的像素数量上存在差异。通过分析不同区域的自相关函数（ACF）曲线，发现所有 CSRM 技术都显示纤维上区域的扩散最慢，混合区域次之，非纤维区域最快。基于结构重建质量、强度 - 扩散反相关模式以及纤维上像素识别的变异系数，研究人员选择 SRRF 和 MSSR 作为代表技术，它们能有效区分纤维上和混合像素。
- 基于 CSRM 掩模方法的Doff、Don和Dmixed的变异性：研究人员提取了不同像素区域的扩散系数（D 值），发现 SRRF 提供的Don测量最精确，变异系数最低。其他方法的Don值虽可比，但精度稍逊。混合像素在所有方法中都显示出较高的 D 值，表明其受非纤维区域的部分影响。此外，研究还验证了不同方法中Doff值的一致性，这说明Don值的差异源于各方法对纤维区域识别的不同，而非分析方法的系统误差。
- 200x 放大倍数下基于 CSRM 的动态分割：研究人员将 EMCCD 相机的放大倍数提高到 200x，进一步研究不同 CSRM 技术的性能。结果显示，DPR、SRRF 和 MSSR 在重建图像时表现相当，能提高分辨率并使纤维变窄；RL 重建的纤维较厚；ESI 和 MUSICAL 显示的纤维较宽；eSRRF 生成的纤维窄但不连续且有噪声。通过对 D 值的分析，SRRF 在 200x 放大倍数下依然表现最佳，Don和Dmixed值最低且变异系数最小。同时，200x 放大倍数下Don和Dmixed的分离度更好，这得益于更高的放大倍数对混合像素和纤维上像素的更好空间隔离。
研究结论与讨论
这项研究优化了 CSRM 与 ImFCS 的整合，评估了多种 CSRM 技术在提取纤维上 D 分布方面的性能。结果表明，RL、DPR、SRRF、MSSR 和 eSRRF 能有效优化Don和Dmixed的计算，其中 SRRF 表现最为突出，提供了最精确的Don值和最低的变异系数。这一研究成果为将 CSRM 与 ImFCS 结合用于亚细胞结构的高分辨率空间和动态表征提供了重要依据。同时，研究还发现较小的像素尺寸在 CSRM 成像中有优势，但会降低 ImFCS 的信噪比。因此，在优化 ImFCS 数据分析时，需根据研究目的权衡像素大小。此外，该研究成果不仅适用于 ImFCS，还为其他荧光技术与 CSRM 的结合提供了参考，有望推动荧光显微镜技术在生命科学研究中的进一步发展，为探索生物系统的奥秘提供更强大的工具。
