优化线粒体 DNA 靶向铂 TALENs：双向调控 m.3243A>G-iPSCs 异质性水平的创新策略

本文聚焦线粒体疾病研究，通过优化线粒体 DNA（mtDNA）靶向铂转录激活样效应核酸酶（mpTALENs），成功双向调控患者来源 m.3243A>G 诱导多能干细胞（iPSCs）的异质性水平。这为研究疾病病理及开发潜在疗法提供了有力工具，极具科研与临床价值。

　　

研究背景

线粒体 DNA（mtDNA）突变引发的线粒体疾病，严重影响人类健康。其中，m.3243A>G 突变是常见的 mtDNA 突变类型，与线粒体肌病、脑病、乳酸酸中毒和中风样发作（MELAS）及糖尿病等多种疾病相关。由于每个细胞中同时存在突变型和野生型 mtDNA（即 “异质性”），且线粒体的双层膜结构阻碍了基因编辑工具进入，使得针对 mtDNA 突变的研究和治疗面临诸多挑战。患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）为研究线粒体疾病提供了宝贵的模型。近年来，mtDNA 编辑工具不断发展，如线粒体靶向锌指核酸酶（mtZFN）、mitoTALEN 和 mitoARCUS 等可编程核酸酶，以及 mtDNA 碱基编辑策略，但它们各自存在局限性。本研究旨在优化 mtDNA 靶向铂转录激活样效应核酸酶（mpTALENs），实现对 m.3243A>G-iPSCs 异质性水平的高效、安全调控，推动线粒体疾病的研究和治疗进展。

研究方法

1. iPSC 的生成与培养：获取 m.3243A>G 突变导致的线粒体疾病患者的皮肤活检标本，经伦理批准并获得患者书面知情同意后，将患者的成纤维细胞（B01 和 A04）在含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 抗生素 - 抗真菌溶液的 DMEM 培养基中扩增。通过核转染技术，用六种重编程因子（SOX2、KLF4、OCT3/4、L-MYC、LIN28、p53-shRNA）的附加型载体对成纤维细胞进行重编程。重编程 7 天后，将细胞铺在丝裂霉素 C 处理的 SNL 饲养层上，更换为添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的灵长类胚胎干细胞培养基。待出现 ESC 样集落后，机械分离并转移到新培养板，用 CTK 溶液收获 iPSCs。
2. RNA 分离与 RT-PCR：使用 RNeasy Plus Mini Kit 纯化总 RNA，取 1μg 总 RNA，按照 ReverTra Ace qPCR RT Kit 的说明书进行逆转录反应。采用 TaKaRa Ex Premier DNA 聚合酶进行 PCR，PCR 产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙锭染色。
3. 核型分析：由 OVUS Co., Ltd. 进行标准 G 带染色体分析。
4. EB 介导的 iPSCs 自发分化：将 iPSCs 重悬于含多种成分的 DMEM/F12 培养基中，形成球形聚集体后转移到培养皿进行 8 天悬浮培养，再将自发形成的胚状体（EBs）转移到 Matrigel 基质基底膜生长因子减少的培养板上继续培养 8 天。
5. 免疫细胞化学分析：用 4% 多聚甲醛 / PBS 固定细胞 30 分钟，0.2% Triton X-100 处理 10 分钟，2% BSA/PBS 封闭 1 小时，然后与一抗孵育，洗涤后与二抗孵育，最后用含 DAPI 的 ProLong Diamond Antifade Mountant 封片，通过共聚焦激光扫描显微镜或荧光显微镜观察免疫反应细胞。
6. DNA 分离：使用 NucleoSpin Tissue XS 试剂盒，按照说明书从成纤维细胞和 iPSCs 中分离包括线粒体 DNA 的基因组 DNA。
7. mtDNA 突变分析：用 PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶扩增包含 m.3243 位点的线粒体基因组片段，纯化后通过 Sanger 测序法测序。
8. mtDNA 异质性分析
   • PCR-RFLP 法：用 TaKaRa Ex Taq 或 Tks Gflex DNA Polymerase Low DNA 扩增 DNA，在 m.3243A>G 突变存在时，145bp 的 PCR 产物可被 HaeIII 酶切成 95bp 和 50bp 的两个片段，在 3% 琼脂糖凝胶上分离酶切产物，用 ImageJ 软件分析信号强度比。
   • ARMS-qPCR 法：用 QuantStudio 7 进行 ARMS-qPCR，根据标准曲线计算野生型或突变型 mtDNA 的拷贝数，进而计算 m.3243A>G 异质性水平。
9. 线粒体 DNA 拷贝数测定：使用 ABI PRISM 7900HT 测定 iPSCs 的 mtDNA 拷贝数，根据标准曲线计算靶向 DNA 的拷贝数，进而得出 mtDNA 拷贝数。
10. TALEN 表达质粒的构建：利用 TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0 设计 m.3243G (MUT)- 和 m.3243A (WT)-pTALEN 候选序列，以 mtDNA 3197 - 3288 位序列为靶序列，设置搜索条件筛选设计。使用 Platinum Gate TALEN kit 构建 TALEN 表达质粒，通过 Golden Gate 方法进行四模块组装和最终载体组装。对 p2NI 载体进行修饰，插入合成的包含非传统重复可变二残基（ncRVDs）的 DNA 片段，构建含有 ncRVDs 的 pTALE - DNA 结合模块载体。构建表达 mpTALEN 单体的目的载体，其编码 ATP5B 的线粒体靶向序列（MTS）和 V5 标签；对 mpTALEN 目的载体进行修饰，插入合成的 ELD 突变片段和 PCR 扩增的 KKR 突变片段，构建含有异源二聚体 FokI（ELD/KKR）的 mpTALEN 支架目的载体。
11. SSA 测定：用 PCR 扩增包含 m.3243A 或 m.3243G 的 TALEN 靶序列，插入 pGL4 - SSA 报告质粒的 Xma I 位点。将 TALEN 质粒、报告质粒和用于双荧光素酶测定的参考质粒共转染 HEK293T 细胞，24 小时后用双荧光素酶测定系统测定荧光素酶活性，计算 SSA 活性（Luc/RLuc）和靶特异性。
12. 细胞转染与分选：HEK293T 和 HeLa 细胞用 Lipofectamine 3000 试剂转染。m.3243A>G 突变的患者来源 iPSCs 在无饲养层条件下培养，用 0.5× TrypLE Select 将其解离为单细胞，接种在 iMatrix - 511 包被的培养皿上，用 StemFit AK02N 培养基培养。次日，用 Lipofectamine 3000 试剂将 pCAGGS - EGFP 和 mpTALEN 质粒共转染 iPSCs。转染 2 天后，用 Moflo Astrios 细胞分选仪根据前向散射、侧向散射和 EGFP 表达水平分选细胞，排除死细胞和碎片，将 EGFP 阳性且碘化丙啶（PI）阴性的细胞分选到相应培养基中，部分培养体系添加 50μg/mL 尿苷。
13. 蛋白质免疫印迹分析：收集转染的 HEK293T 细胞，用含蛋白酶抑制剂鸡尾酒的 RIPA 缓冲液裂解，超声处理和离心后，用 Pierce bicinchoninic acid（BCA）蛋白测定试剂盒测定上清液的蛋白质浓度。将蛋白样品变性后进行 SDS - PAGE 电泳，转移到 Immobilon - FL 膜上，用 Revert 700 Total Protein Stain Solution 染色，再用阻断缓冲液封闭，与一抗孵育，洗涤后与 IRDye 800CW Goat anti - Mouse IgG 孵育，最后用 Odyssey CLx 红外成像系统检测蛋白信号。
14. 抗体使用：使用多种一抗，包括小鼠抗 V5 - tag、兔抗 TOM20、小鼠抗 SSEA - 4、山羊抗 NANOG、兔抗 OCT4、小鼠抗 αSMA、山羊抗 SOX17、小鼠抗 NESTIN、兔抗 TUBB3 等，以及相应的 Alexa Fluor 标记的二抗用于免疫荧光研究。
15. 统计分析：使用 Holm - Sidak 方法确定两组之间差异的统计学意义，三组或四组之间的比较采用单因素或双因素方差分析（ANOVA），随后进行 Tukey 检验，p值 < 0.05 认为差异具有统计学意义。

研究结果

1. m.3243G (MUT)-pTALEN 和 m.3243A (WT)-pTALEN 的开发：设计多种 m.3243G (MUT)-pTALENs，通过基于哺乳动物细胞的单链退火（SSA）测定评估其活性和特异性，发现 pTALEN (BL)/pTALEN (FR) 对突变型 mtDNA 的切割特异性最高。对识别 m.3243G 核苷酸的 RVD 进行修饰，引入 ncRVDs（如 LK、WK 等），结果显示 p [CL6LK/MR] 和 p [PL6LK/MR] 等修饰后的 TALENs 对突变型的切割活性和特异性更高，其中 p [PL6LK/JR] 组合表现最佳。同样地，设计 m.3243A (WT)-pTALENs，筛选出 p [PLW6NM/QR] 和 p [PLW6NM/JR] 作为候选，它们对野生型序列具有较高的切割活性和特异性。
2. iPSCs 的生成与鉴定：成功从两名 m.3243A>G 突变的线粒体疾病患者的成纤维细胞中重编程获得 iPSCs，这些 iPSC 克隆无附加型载体整合，m.3243A>G 的异质性水平存在差异。选取部分 iPSC 克隆进行研究，它们具有人类胚胎干细胞样形态、正常核型，且多能性标记物呈阳性。
3. mpTALENs 对 iPSCs 异质性水平的影响：将筛选出的 pTALENs 修饰为线粒体定位的 Lv - mpTALENs，免疫荧光分析显示其能有效定位于线粒体。在 m.3243A>G-iPSCs 中，Lv - mpTALEN (PL6LK)/Lv - mpTALEN (JR) 和 Lv - mpTALEN (PL6WK)/Lv - mpTALEN (JR) 可降低 m.3243A>G 异质性水平；Lv - mpTALEN (PLW6NM/JR) 和 Lv - mpTALEN (PLW6NM/QR) 则可增加 m.3243A>G 突变型 mtDNA 的比例。转染后第 2 天，mpTALEN 处理组与对照组相比，mtDNA 拷贝数无显著差异，表明细胞可能通过 mtDNA 复制部分补偿了因切割导致的 mtDNA 减少。
4. 异源二聚体 pTALENs 的评估：引入异源二聚体 FokI（ELD/KKR）结构域，构建 pTALEN - ELD 和 pTALEN - KKR。SSA 测定结果显示，引入该结构域导致切割活性适度下降，但提高了靶特异性，减少了非靶 mtDNA 切割。将异源二聚体 pTALENs 修饰为 Lv - mpTALENs 后，可通过蛋白质免疫印迹检测到，免疫细胞化学证实其定位于线粒体。
5. 异源二聚体 m.3243G (MUT)-mpTALEN 的长期作用：长期监测 m.3243G (MUT)-mpTALEN 转染的 #54D6-iPSCs，发现异源二聚体 mpTALENs（如 mp [PL6LK - ELD/JR - KKR] 和 mp [PL6WK - ELD/JR - KKR]）比传统 mpTALENs 更有效地降低突变负荷，且能抑制 mtDNA 拷贝数减少。经过多次转染，最终获得了异质性水平为 11% 的 #54D6-iPSCs。
6. 异源二聚体 m.3243G (MUT)-mpTALEN 的脱靶效应：在无 m.3243A>G 突变 mtDNA 的细胞中评估异源二聚体 m.3243G (MUT)-mpTALENs 的脱靶活性，发现 mp [PL6LK - ELD/JR - KKR] 和 mp [PL6WK - ELD/JR - KKR] 对正常 mtDNA 仍有轻微的切割作用，导致 mtDNA 拷贝数略有下降。
7. 异源二聚体 m.3243A (WT)-mpTALEN 的长期作用：在 #54D6-iPSCs 中验证 m.3243A (WT)-mpTALEN 增加突变负荷的效果，异源二聚体 mp [PLW6NM - ELD/JR - KKR] 在转染后第 2 天可使突变负荷增加至 92%，但到第 10 天突变型 mtDNA 比例回落。在 #50V4-iPSCs 中，mp [PLW6NM - ELD/JR - KKR] 处理后异质性水平在第 2 天有所增加，但 25 天后差异减小。添加尿苷可减少 #54D6-iPSCs 中突变负荷随时间下降的趋势。通过分离和亚克隆 m.3243A (WT)-mpTALEN 处理的 #54D6-iPSCs 菌落，获得了突变负荷高达 97% 的亚克隆。
8. mpTALEN 处理的 iPSCs 的分化能力：尽管 mpTALEN 处理的 #54D6-iPSCs 突变负荷不同，但均保持了分化能力，可通过 EB 介导的体外自发分化为内胚层（Sox17 阳性）、外胚层（Nestin 和 TUBB3 阳性）和中胚层（ACTA2 阳性）细胞。较高的 m.3243A>G 突变负荷对分化细胞中αSMA表达有一定影响，但即使突变负荷为 96% 的 #54D6-iPSCs 分化细胞中，αSMA表达水平仍高于突变 - free 的 A01#15_MyoD33 - 4 克隆分化细胞的 60%。

研究讨论

本研究成功开发并优化了靶向 m.3243A>G 突变型或野生型 mtDNA 的 mpTALENs，实现了对 m.3243A>G-iPSCs 异质性水平的双向调控。该双向系统有助于研究 m.3243A>G 突变负荷与疾病表型之间的关系，为开发针对 m.3243A>G 疾病的有效安全疗法奠定了基础。研究中使用的 ncRVDs（如 LK/WK 和 NM）提高了切割活性和靶特异性，异源二聚体 FokI 结构域增加了靶特异性并减少了因脱靶切割导致的 mtDNA 拷贝数损失。通过尿苷补充和亚克隆等技术，获得了一系列具有不同突变负荷且能分化为三个胚层的 iPSCs，为研究不同遗传背景下的 m.3243A>G 病理提供了有价值的工具。与传统的 TALENs 中使用的常规 RVDs 相比，ncRVDs 在识别特定核苷酸时表现出更高的特异性。本研究首次将 ncRVDs 应用于靶向点突变 mtDNA 的 TALENs 设计，发现 LK 和 WK 在识别 m.3243G 方面比常用的 NK 更有效，而 NM 对野生型序列的特异性略高于 HY。未来可进一步研究相同的 ncRVD 是否适用于其他 A/G 突变导致的线粒体疾病 mtDNA，以及探索更多 ncRVD 的可能性。与其他线粒体核酸酶（如 mito - CRISPR）相比，mpTALEN 系统具有一定优势。mito - CRISPR 在将 Cas 蛋白和引导 RNA（gRNA）导入线粒体时面临困难，且尚未成功在异质性细胞中修改突变负荷。而 mpTALEN 系统使用 ncRVDs，可能更易于推广应用于临床和基础研究。与之前报道的 mitoARCUS 和 A3243G - mitoTALEN 相比，mpTALEN 系统也各有优劣。mitoARCUS 在降低 m.3243A>G 突变负荷方面表现出色，但 mpTALEN 系统具有更小的尺寸，更适合包装在重组腺相关病毒（AAV）衣壳中，便于在动物模型中递送。研究发现 mpTALEN 处理的细胞在转染后第 2 天 mtDNA 拷贝数下降，这可能是多种因素导致的，包括 FokI 切割活性、细胞分选等。使用异源二聚体 ELD/KKR mpTALEN 对可减少脱靶 mtDNA 切割，增强靶特异性切割，但仍未完全消除脱靶效应，未来需进一步优化以降低脱靶风险。此外，还需确定 mtDNA 突变负荷导致病理性线粒体功能障碍的阈值，通过体内模型探索最适宜的递送技术和其他相关变量，以实现 mpTALEN - 基于治疗的最佳效果。总体而言，本研究成功构建了双向 mpTALEN 系统，为线粒体疾病研究提供了强大的工具。未来应致力于将这些研究成果转化为临床应用，提高 mpTALEN - 基于疗法的安全性和有效性，为治疗 m.3243A>G 及其他线粒体疾病带来新<