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本文通过 16S rRNA 基因扩增子测序，研究猪肉加工设施中两条生产线的肉品和接触表面微生物特征。发现微生物群在不同生产线、样本类型、加工日期和时间存在差异，这些结果有助于定制化提升新鲜猪肉安全与质量（DOI: 10.1128/aem.00044 - 25）。
### 研究背景
将活肌肉组织转化为食物是一个复杂过程，涉及动物屠宰前后的生化因素，屠宰和去骨过程中的多个步骤依赖自动化设备和人工操作，这会影响后续加工设备和肉品的微生物生态。新鲜肉因营养丰富易受微生物污染，其核心微生物群主要来源于动物自身和环境，微生物污染会影响肉品保质期和食品安全。接触表面是腐败菌的常见来源，还可能促进病原体滋生，其微生物群在不同加工线存在差异，且微生物会在接触表面和肉品间转移，人工操作也会影响新鲜猪肉微生物群。当前对新鲜猪肉微生物生态的研究存在局限，本研究旨在填补这些空白，对同一工厂两条加工线的接触表面和肉品微生物生态进行多日期和生产班次的特征分析，并开发了新的样本分析方法。
实验方法
- 样本采集：在大型猪肉加工厂的两条新鲜猪肉加工线采集肉品和接触表面拭子样本，采样时间为每周三天，连续五周加第六周一天，共 16 个采样日。肉品样本约 1600 - 2000g，接触表面样本在特定区域采样，样本采集后冷藏保存并及时送往实验室处理。
- 样本处理与测序：对肉品和接触表面样本进行 DNA 提取，通过实时荧光定量 PCR（qPCR）测定 16S rRNA 基因扩增子拷贝数，扩增 V3 - V4 区域构建文库后在 Illumina NextSeq 2000 仪器上测序。
- 生物信息学分析：利用 R 统计软件和相关包对测序数据进行处理，去除接头和引物序列，进行质量过滤、去噪、微生物推断、分类学注释，识别并去除潜在污染物，之后进行微生物群分析。
实验结果
- 测序数据概况：所有样本 16S rRNA 扩增子平均拷贝数为 854 copies/μL，肉品样本为 1449 copies/μL，接触表面样本为 260 copies/μL。共产生 78.6 M 双端 reads，质量控制和去污染后剩余 33.7 M reads 用于分析，大部分 reads 在 DADA2 的 filterAndTrim 函数中被去除。
- 微生物群差异分析
- 加工日期、加工线和样本类型的影响：加工日期、加工线、样本类型和班次时间均与微生物群 β 多样性显著相关，占总解释变异的 23%。非度量多维缩放（NMDS）排序显示不同加工线和样本类型的微生物群存在显著聚类差异。
- 肉品和接触表面微生物群差异：同一加工线内肉品和接触表面微生物群不同，不同加工线间微生物群也不同。许多属在不同加工线肉品、接触表面样本间丰度存在显著差异，通过 UpSet 图分析发现不同样本类型间共有和独特的扩增子序列变异（ASVs）及属存在差异。
- 加工班次内微生物群变化：班次时间与各加工线肉品和接触表面样本微生物群 β 多样性显著相关，表明微生物群在班次内发生变化。UpSet 图显示不同班次时间点肉品和接触表面样本共有和独特的 ASVs 存在差异。
- 食品安全和质量相关关键分类群的差异：不同加工线和加工班次内，与食品安全和质量相关的关键分类群丰度存在差异。例如某些菌属在班次结束时丰度增加，不同加工线和样本类型中 Clostridium sensu stricto 1（CSS1）的丰度变化不同，且部分 CSS1 ASVs 在不同加工线和样本类型中分类不同。SourceTracker 分析表明肉品和接触表面相互贡献微生物群，同时存在未知微生物来源。
- 加工日期相关的微生物群变化：加工日期与微生物群 β 多样性显著相关，NMDS 排序显示不同加工日期样本的质心不重叠。UpSet 图显示每天独特的 ASVs 占总 ASVs 的 27% - 30%，但多数属在所有加工日期共享。
讨论
- 肉品相关微生物群的早期建立和分化：研究表明不同加工线的肉品和接触表面微生物群落不同，微生物群差异可能在屠宰后早期开始，进一步加工过程中微生物群分化加剧，这有助于制定针对性干预措施。
- 影响加工链中微生物分化的因素：微生物群分化受多种因素影响，包括动物皮肤细菌群落、屠宰后过程差异、环境和处理条件不同等。不同加工线的操作差异导致微生物群差异，未来研究应在屠宰和去骨过程多阶段采样。
- 时间变异性及其对产品保质期的潜在影响：加工日期与微生物群变异性关联最大，了解原料微生物特征和加工环境变异有助于提高产品质量一致性和减少保质期问题，应考虑针对上游变异的干预措施。本研究存在局限性，未涉及其他工厂和不同季节，且仅研究了第一个生产班次。
- 班次内时间动态作为靶向干预的生物标志物：某些细菌属在班次内丰度增加，BBT 加工线设计使其细菌丰度更高。针对性干预措施如中班卫生清洁或改进卫生设计，可能改善肉品安全和质量风险，未来研究可评估其效果和成本。
- 肉类加工中亚属水平微生物群分析的见解：16S rRNA 基因扩增子测序能全面分析新鲜猪肉微生物群，微生物群在属内物种和菌株水平存在差异，影响肉品腐败、热抗性和生物膜形成，深入了解这些动态对设计有效干预措施至关重要。
研究结论
本研究表明不同加工线及同一加工线内肉品和接触表面微生物生态存在差异，与食品安全和产品质量相关的关键分类群的时间动态可作为潜在生物标志物。肉类加工商虽无法控制所有微生物变异来源，但减少变异因素和实施靶向干预，有助于提高新鲜猪肉产品的食品安全和保质期。
