利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）芽孢展示技术固定海藻酸 C-5 差向异构酶：开拓海藻酸工业应用新方向

本文聚焦海藻酸差向异构酶，利用枯草芽孢杆菌芽孢展示技术对 AlgE1、AlgE4 和 AlgE6 进行固定化研究。结果显示 AlgE4 在芽孢表面具活性且可循环利用，还优化了芽孢展示蛋白的 TEV 酶切条件。该研究为海藻酸差向异构酶的工业应用开辟新路径。

　　### 研究背景
海藻酸（Alginates）是褐藻中含量最丰富的多糖，由 β-D - 甘露糖醛酸（M）和其 C-5 差向异构体 α-L - 古洛糖醛酸（G）通过（1→4）连接而成。海藻酸广泛应用于食品、饲料、技术和制药等行业，全球市场年需求量约 35,000 吨且呈增长趋势。海藻酸的可用性和价值取决于其组成和链长，其中 G - 块具有增粘和胶凝特性，高 G 含量的海藻酸商业价值更高。

细菌海藻酸差向异构酶分为 AlgG 型和 AlgE 型，AlgE 型是 Ca²⁺依赖的胞外酶，能够沿着底物进行过程性作用，创造 MG - 或 G - 块，是本研究的重点。从棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii）中选取 AlgE1、AlgE4 和 AlgE6 进行研究，它们在大小、模块组成和产物形成方面存在差异 。

在工业应用中，使用酶存在分离困难和难以重复利用的问题，而酶固定化技术可解决这些问题。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的芽孢在营养缺乏时形成，具有高度稳定性，能够抵抗多种外界影响，且易于基因操作和培养，是理想的蛋白质展示平台。本研究旨在通过将海藻酸差向异构酶固定在枯草芽孢杆菌芽孢表面，构建一个有弹性且可回收的系统，提高酶在工业应用中的效率。

材料和方法

1. 转化和菌株：使用复制穿梭质粒在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示融合蛋白，以 CotY 作为融合伙伴和锚定蛋白，在芽孢形成过程中将融合蛋白整合到最外层的芽孢壳中。通过无缝连接克隆提取物创建质粒，并转化到大肠杆菌（Escherichia coli）中进行保存。利用枯草芽孢杆菌的自然感受态和高拷贝穿梭质粒将质粒转化到枯草芽孢杆菌中，使用的菌株 BS02003 为萌发缺陷型，可防止芽孢发育成活细胞。
2. 芽孢形成：通过营养饥饿诱导枯草芽孢杆菌菌株芽孢形成。对于表达绿色荧光蛋白（GFP）的菌株，使用补充葡萄糖至最终浓度为 0.5 g/L 的 DSM 培养基进行芽孢形成；对于表达差向异构酶的菌株，使用 80% 2× Schaeffer’s 葡萄糖培养基和 20% 500 mM 3-(N - 吗啉代) 丙烷磺酸（MOPS）缓冲液（pH 6.8）的混合培养基进行芽孢形成。将预培养物接种到芽孢形成培养基中，起始光密度（OD_600nm）为 0.1，在 37°C、225 转 / 分钟的振荡培养箱中孵育 48 小时。
3. 芽孢纯化：通过显微镜检查确认芽孢形成后，通过离心收获培养物。将沉淀重悬于含有 0.5 mg/mL 鸡卵清溶菌酶的缓冲液中，孵育 1 小时以裂解剩余细胞，再通过离心和重悬进行两次洗涤，最后将芽孢重悬于少量缓冲液中，并调整 OD_600nm至所需密度，于 4°C 储存。
4. TEV 酶切 GFP 展示芽孢：构建了 CotY 与 GFP 变体 sfGFP 的 N - 和 C - 末端融合菌株，使用柔性富含甘氨酸的接头（GGGGS）₂和更刚性的 α- 螺旋形成接头（EAAAK）₃。在含有 50 mM Tris-HCl pH 7.5、1 mM 二硫苏糖醇（DTT）、0.5 mM 乙二胺四乙酸和 200 单位 / 毫升（U/mL）烟草蚀纹病毒蛋白酶（TEV）的反应混合物中孵育芽孢 18 小时，通过离心分离上清液并测量荧光，每个条件进行 6 次重复测量。
5. TEV 酶切优化：以 N - 末端连接的具有柔性接头的 GFP 展示菌株 GFP-N-Flex 为对象，优化反应条件。测试不同浓度的 TEV 蛋白酶、牛血清白蛋白（BSA）和芽孢 OD_600nm对酶切效果的影响，反应在 30°C、1,400 转 / 分钟的条件下孵育 18 小时，通过测量上清液荧光确定最佳酶切条件。
6. TEV 酶切差向异构酶展示芽孢：在差向异构化反应所用的 HEPES 缓冲液（20 mM HEPES、75 mM NaCl、2.5 mM CaCl₂、pH 6.9）中对展示 AlgE4 的芽孢进行酶切。使用最终芽孢 OD_600nm为 10、0.2% BSA 和 400 U/mL TEV 蛋白酶的反应体系，DTT 浓度为 2 mM，在 30°C、1,400 转 / 分钟的条件下孵育 18 小时，离心分离上清液和芽孢，分别用于后续的海藻酸差向异构化反应。
7. 海藻酸底物：从 AlgG 缺陷型的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株中制备聚 M（PolyM）底物，通过酸水解将其数均聚合度调整到 DP = 70 - 100。使用¹³C-1 标记的 D - 果糖制备¹³C-1 标记的聚 M，采用相同的酸水解方法进行解聚，所得聚 M 未乙酰化，与海藻中的聚 M 化学性质相同。
8. 海藻酸差向异构化：在 HEPES 缓冲液中进行差向异构化实验，将纯化的芽孢调整到 OD_600nm为 10（除非另有说明），将 200 μL 芽孢悬浮液与 426 μL 10 mg/mL 的聚 M 溶液混合，在 1,000 转 / 分钟的摇床上孵育。反应结束后，通过离心分离上清液，将上清液冷冻干燥用于后续的核磁共振（NMR）分析。
9. 芽孢回收：使用相同批次的 AlgE4-C-Rigid 芽孢进行五轮差向异构化反应，每次反应在 37°C 下进行 12 小时。反应结束后，离心分离芽孢和上清液，将芽孢重悬于新鲜的聚 M 溶液和 HEPES 缓冲液中，继续进行下一轮反应，对每轮反应的上清液进行处理和分析。
10. 产物表征：差向异构化反应后，将反应混合物冷冻干燥，重新溶解在含有 0.05% 3-(三甲基硅基)- 丙酸 - 2,2,3,3-d₄酸钠盐作为内标和 0.01 M 三乙四胺六乙酸作为钙螯合剂的 D₂O 中。在 83°C 下对每个样品进行 1D ¹H 光谱分析，使用 BRUKER NEO 600 MHz 仪器和 5 mm iProbe TBO 探头。
11. 时间分辨 NMR 分析：将¹³C-1 标记的聚 M（DP ~70，10 mg/mL）溶解在含有 5 mM MOPS pH 6.9、2.5 mM CaCl₂和 75 mM NaCl 的 D₂O 缓冲液中，转移 160 μL 到 NMR 管中。在 NMR 磁体中预热至 50°C，记录 1D ¹H 和¹³C 光谱。加入 80 μL 芽孢（OD_600nm为 20），混合后放回磁体，每 10 分钟记录一次 1D ¹³C 光谱，共记录 15 小时 20 分钟，最后记录¹H-¹³C HSQC 光谱。使用 Bruker Avance III HD 800 MHz 光谱仪和 5 mm Z 梯度 CP-TCl（H/C/N）低温探头进行测量，使用 TopSpin 软件进行光谱记录、处理和分析。

研究结果

1. AlgE4 在芽孢表面具有活性并产生 MG - 块：构建了展示 AlgE4 的融合菌株库，包括 N - 和 C - 末端连接的不同变体，每种变体使用柔性和刚性接头。通过 NMR 光谱分析发现，所有四个含有 AlgE4 的菌株都显示出酶活性，其中 C - 末端连接的 AlgE4 菌株活性更高。选择 AlgE4-C-Rigid 菌株进行进一步研究，通过时间分辨 NMR 分析其与聚 M 的反应，结果表明反应生成了 MG - 块，未形成 G - 块，总 G 生成量约为 40%，且可通过调整芽孢 OD_600nm和温度获得所需产物量。
2. 芽孢表面的 AlgE4 可回收利用：对 AlgE4-C-Rigid 芽孢进行五轮 37°C、12 小时的差向异构化反应，以评估芽孢展示的差向异构酶的可回收性。第一轮反应中 F_G = 0.16，第二轮 F_G = 0.11，活性相比第一轮降低 34%。在第五轮反应中，活性降至 24%，F_G = 0.04，但仍具有活性，表明该系统在优化回收过程后具有降低工业应用中酶成本的潜力。在 50°C 下尝试回收时，酶活性在第一轮回收后迅速下降，第四轮反应中未检测到差向异构化。
3. TEV 酶切系统的优化：构建展示 CotY-sfGFP 融合蛋白的菌株库，通过荧光测量监测接头酶切情况。结果显示，除对照菌株外，所有变体在 TEV 处理和未处理样品之间存在显著差异。C - 末端融合的 sfGFP 在酶切后上清液中的荧光显著高于 N - 末端融合的情况，且刚性接头变体释放到溶液中的 sfGFP 少于柔性接头变体。选择 GFP-N-Flex 菌株进一步优化酶切条件，发现添加 0.2% BSA 对荧光水平有积极影响，在特定芽孢 OD_600nm和 TEV 浓度下，提高 BSA 浓度和 TEV 浓度可增加荧光，但过高的 BSA 浓度和 TEV 浓度增加幅度有限。
4. AlgE4 从芽孢表面被酶切下来：构建具有柔性或刚性接头和 TEV 识别位点的 AlgE4 展示菌株，用 TEV 蛋白酶处理后进行差向异构化反应并通过 NMR 分析。结果表明，所有菌株在 TEV 处理后的上清液中差向异构化活性均高于未处理的上清液样品。对于 N - 末端连接的 AlgE4 菌株，处理和未处理的上清液样品之间的活性差异更为显著。C - 末端连接的 AlgE4 菌株在未处理的上清液中背景活性较高，可能是由于蛋白在振荡过程中从芽孢壳上脱落。对 AlgE1 和 AlgE6 展示菌株进行酶切后未检测到活性，可能是由于蛋白错误折叠或表达问题导致其本身无活性。AlgE4 在芽孢表面的活性不受固定化影响，且 C - 末端连接的 AlgE4 活性更高，可能是因为其具有更长的柔性区域，使酶更容易接触底物。此外，首次在 NMR 管中进行芽孢展示的 AlgE4 差向异构化反应并记录时间分辨 NMR 光谱，为研究固定化酶的作用模式提供了新方法。

结论和展望

本研究对固定在枯草芽孢杆菌芽孢表面的过程性、非裂解性酶进行了表征。AlgE1 和 AlgE6 在芽孢表面无活性，而 AlgE4 具有活性，且 C - 末端融合时活性更高。芽孢展示的 AlgE4 在循环使用五次后仍保留 24% 的初始活性，通过调整芽孢用量可调节差向异构化程度，显示出芽孢在海藻酸差向异构化中的应用潜力。此外，芽孢展示的蛋白可通过 TEV 蛋白酶从芽孢表面酶切下来，释放后的 AlgE4 活性增加。未来可研究其他蛋白酶或自切割接头对酶切效率的影响，进一步优化固定化酶的应用。目前，量化芽孢表面结合的酶仍是一个挑战，通过酶切并测量释放酶的活性，有助于更好地理解和比较结合态和游离态酶的活性，为该领域未来研究提供参考，结合芽孢的可扩展生产和分离，为海藻酸差向异构酶的工业应用带来广阔前景。