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本文聚焦抗菌肽（AMPs）研究。利用 CASPON 技术生产 Plectasin，测试其对革兰氏阳性和阴性菌的抗菌活性。通过透射电镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）观察细菌形态变化。结果表明该技术可有效生产 Plectasin，为抗菌肽研究提供重要参考。
### 抗菌肽 Plectasin 研究背景
抗菌药物在人类、畜牧和农业的广泛使用，导致大量耐药菌株出现，这对未来构成严重威胁，促使科研人员致力于开发抗生素替代品。抗菌肽（Antimicrobial Peptides，AMPs）作为有前景的替代物，通常由 33 - 44 个氨基酸组成，含至多三个二硫键以维持结构稳定。它能抑制细菌生长、灭活病毒，甚至对癌细胞有作用，且具有更广泛的治疗谱、高选择性毒性和快速杀菌作用。
Plectasin 是一种从真菌中发现的抗菌肽，可破坏细菌维持肽聚糖层的能力，对革兰氏阳性菌有显著抗菌活性，但其作用机制尚未完全明确。研究表明，它可能通过与肽聚糖层生物合成过程相互作用，形成 plectasin / 脂质 II 复合物，阻碍肽聚糖层的正确组装。
本研究借助 CASPON 平台技术生产 Plectasin，该技术通过优化可高效纯化肽和蛋白质，其中 CASPON - tag 可增强目标蛋白 / 肽在大肠杆菌中的可溶性表达，并方便进行亲和层析。研究旨在验证利用该平台生产的 Plectasin 是否保留结构完整性和抗菌活性，同时探究 Plectasin 对革兰氏阳性菌形态的影响，特别是对肽聚糖层的作用。
材料和方法
- 大肠杆菌生产菌株和生物质：Plectasin 在大肠杆菌 BL21 (DE3) 的周质中表达，与 N 端 CASPON - tag（4.14 kDa）融合，并结合外膜蛋白 A（OmpA）的信号序列以实现转运。表达盒经设计后整合到基因组中，发酵后收集细胞悬浮液，离心获得生物质沉淀并储存于 - 20°C。
- 纯化步骤：在实验室规模进行纯化，重复三次以验证可重复性。具体步骤包括细胞裂解和澄清、固定金属亲和层析（IMAC）捕获、透析和稀释、CASPON 酶切割、减法 IMAC 和稀释、阳离子交换（CEX）以及超滤等。
- 抗菌活性测定：选取四种革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus、肺炎链球菌 Streptococcus pneumoniae、单核细胞增生李斯特菌 Listeria monocytogenes、粪肠球菌 Enterococcus faecalis）和四种革兰氏阴性菌（铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa、大肠杆菌 Escherichia coli等）作为测试菌株。通过制备测试平板、进行药敏试验，测定最小抑菌浓度（MIC），并评估结果的变异性和准确性。
- 透射电子显微镜（TEM）：制备革兰氏阳性菌悬浮液，与 Plectasin、CASPON - plectasin 或 PBS 缓冲液混合孵育，洗涤后进行负染色，在 TEM 下观察并对细胞损伤情况进行定量分析。
- 原子力显微镜（AFM）：进行 AFM 测量前，校准悬臂的灵敏度和弹簧常数。制备细菌样品，使其吸附在玻璃载玻片上，进行成像和力谱测量，分析细胞厚度、刚度和粗糙度等参数。
- 统计分析：对测量数据进行汇总，使用方差分析（ANOVA）和 Student’s t - 检验，比较 Plectasin/CASPON - plectasin 处理组与未处理组细菌表面粗糙度和刚度的差异，以确定其显著性。
- 分析方法：采用十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）、反相高效液相色谱（RP - HPLC）和质谱等方法对 Plectasin 进行定性和定量分析，监测纯化过程并评估纯度。
实验结果
- Plectasin 的纯化：对用于生产生长抑素 - 28（SST）的 CASPON 平台工艺进行调整，用于 Plectasin 的纯化。通过 SDS - PAGE 和 RP - HPLC 分析，证实了 CASPON - plectasin 和 Plectasin 的预期分子量，且最终产品纯度较高。整个纯化过程的总收率为 45%，各下游步骤的摩尔收率除稀释步骤外，均约为 85%。
- 抗菌活性评估：建立了通过微孔板测定 MIC 的活性测定方法。结果显示，Plectasin 对革兰氏阳性菌有明显的生长抑制作用，其 MIC 在 4 - 128 μg/mL 之间，与文献报道相符；而对革兰氏阴性菌无生长抑制作用，高浓度时甚至促进其生长。CASPON - plectasin 对所有测试细菌均无生长抑制作用。
- TEM 测量结果：TEM 观察发现，未处理的革兰氏阳性菌细胞形态完整，表面光滑；Plectasin 处理后，不同细菌细胞出现不同程度的损伤，如金黄色葡萄球菌表面形成尖刺，肺炎链球菌出现坑状凹陷等；CASPON - plectasin 处理的细胞形态与未处理的相似，但粪肠球菌表面出现黑点。
- AFM 测量结果：AFM 图像显示，未处理的细菌细胞形状光滑，Plectasin 处理导致细胞变形，肽聚糖层受损，表面粗糙度增加约两倍，细胞刚度降低约三分之一；CASPON - plectasin 处理的细菌细胞形态、粗糙度和刚度与未处理的相近。
讨论
本研究利用 CASPON 技术成功生产并纯化了 Plectasin，对其进行了全面的活性和作用机制研究。通过对纯化工艺的调整，提高了 Plectasin 的产量和纯度，总收率达到 45%，优于之前 SST 的纯化结果，也比其他文献报道的方法更高效。
抗菌活性测试表明，Plectasin 对革兰氏阳性菌有抗菌活性，对革兰氏阴性菌无明显作用，而 CASPON - tag 会使 Plectasin 失活，可能是由于其屏蔽了 Plectasin 的活性位点。这一发现对于利用 CASPON 平台生产其他可能对大肠杆菌生产宿主有害的 AMPs 具有重要意义。
通过 TEM 和 AFM 观察发现，Plectasin 会破坏革兰氏阳性菌的肽聚糖层，导致细胞表面出现损伤，粗糙度增加，刚度降低；而 CASPON - plectasin 对肽聚糖层无明显影响。这些结果表明，Plectasin 不仅干扰新肽聚糖的合成，还影响现有肽聚糖层和细胞膜修复机制。
综上所述，CASPON 平台技术可有效用于肽的纯化，生产出具有生物活性的 Plectasin，保留了其三个二硫键。本研究为进一步研究 AMPs 提供了重要基础，有助于开发对抗多重耐药菌的新策略。未来，CASPON 技术有望用于生产适合医疗应用的各种 AMPs，为解决耐药菌问题提供新途径。
