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本文通过冷冻电镜技术解析了 THIK1（TWIK-related Halothane Inhibited K+ channel 1）钾离子通道的结构，发现其独特结构特征，确定了挥发性麻醉剂（VA）结合位点及作用机制，为调控小胶质细胞功能、治疗神经退行性疾病的药物研发提供关键依据。
### 研究背景
串联孔结构域（K2P）钾离子通道在人体生理过程中至关重要，其中 THIK1（TWIK-related Halothane Inhibited K
+ channel 1）通道在小胶质细胞中表达。小胶质细胞作为中枢神经系统（CNS）的主要免疫细胞，其功能受 THIK1 通道调控，在神经退行性疾病发病机制中扮演重要角色，因此 THIK1 通道成为潜在治疗靶点。
目前，由于缺乏对 THIK1 通道结构、门控机制和药理学的了解，研究其在小胶质细胞特定功能中的作用受到限制。已知 THIK1 可被某些脂质增强活性，且挥发性麻醉剂（VA）能抑制 THIK1 电流，但具体机制不明，这促使研究人员深入探索 THIK1 通道的奥秘。
研究方法
- 表达与纯化：利用杆状病毒系统在 HEK293 哺乳动物细胞中表达并纯化人 THIK1 蛋白，通过一系列步骤获得纯化的 THIK1 蛋白，用于后续实验。
- 冷冻电镜（cryo-EM）：将纯化的 THIK1 蛋白冷冻制样，在 Titan Krios G3i 显微镜上收集数据，经复杂的数据处理流程，最终构建出 THIK1 通道的结构模型。
- 电生理记录：在非洲爪蟾卵母细胞上采用双电极电压钳（TEVC）技术，记录 THIK1 野生型及突变体的电流，研究通道功能及麻醉剂的影响。
- 光标记与质谱分析：使用氮杂异氟烷对 THIK1 蛋白进行光标记，结合质谱分析确定 VA 结合位点。
- 分子动力学模拟：运用 NAMD3 和 CHARMM36 力场进行模拟，研究异氟烷与 THIK1 通道的结合情况及结合自由能。
- 荧光细胞成像：对转染的 HEK293S GnTi?细胞进行荧光成像，探究 THIK1 通道糖基化对其细胞定位的影响。
研究结果
- THIK1 通道结构特征
- 整体结构：THIK1 通道呈典型 K2P 结构，为二聚体，胞外有结构域交换的帽状结构，中央孔由 TM2 和 TM4 螺旋形成。帽状结构域的 N59 和 N65 位点存在糖基化，对促进细胞膜转运和防止细胞降解有重要作用，但不影响通道功能。
- 独特结构：THIK1 通道有独特的中央门控元件，由 TM4 螺旋的 Y273 残基形成封闭的酪氨酸门（Y-gate），位于选择性滤器下方，将内孔分为上下两部分，限制离子通过。此外，TM2/TM3 环有独特结构，部分区域有序且向内弯曲；通道核心还有类似脂质的密度，位于选择性滤器后方。
- Y-gate 的功能及对麻醉剂抑制的影响
- Y-gate 对通道活性的调控：Y273 位点突变会增加 THIK1 电流密度，表明 Y-gate 是限制钾离子流动的关键调节元件。氨基酸大小和化学性质对突变体功能影响显著。
- Y-gate 与麻醉剂抑制的关系：Y-gate 关闭是 VA 抑制 THIK1 的必要条件，Y273 或其相邻的 I139 残基突变会导致对异氟烷的敏感性丧失，N-ring 的 N143 和 N277 残基突变也会影响异氟烷敏感性，表明它们参与调节 Y-gate 的开闭。
- VA 结合位点的确定
- 光标记确定结合位点：通过氮杂异氟烷光标记和质谱分析，确定了 4 个潜在的 VA 结合位点，其中 L146 位点突变影响异氟烷敏感性，是功能关键位点。
- 模拟与验证：分子动力学模拟确定了异氟烷结合的疏水口袋，突变口袋内残基会减弱 THIK1 对异氟烷的敏感性，计算得到的结合自由能对应的 KD值在临床相关浓度范围内。
- TM2/TM3 环对通道功能的调节：THIK1 的 TM2/TM3 环部分区域有序且独特，替换或突变该区域关键残基会增强 THIK1 基础电流，降低对异氟烷的敏感性，表明该区域对抑制 THIK1 通道开放起重要调节作用。
- 脂质对 THIK1 功能的影响：THIK1 结构中选择性滤器后方的脂质结合口袋突变会改变 THIK1 基础电流，但不影响异氟烷抑制作用，说明该脂质结合位点可能通过独立于 VA 介导 Y-gate 关闭的途径调节 THIK1 功能。
研究结论
本研究首次解析了 THIK1 通道的冷冻电镜结构，揭示了其独特结构特征，确定了 VA 结合位点和作用机制。THIK1 通道的 Y-gate、TM2/TM3 环和脂质结合口袋在通道功能调节中起关键作用。尽管 THIK1 与其他 K2P 通道对 VA 的反应不同，但 VA 作用位点存在重叠，且可能通过直接结合蛋白发挥作用。这些发现为深入理解 THIK1 通道功能、开发调节小胶质细胞功能的药物提供了重要基础，不过脂质对 THIK1 通道门控的影响还需进一步研究。
