S100A9：糖尿病足溃疡治疗的新希望 —— 挖掘关键靶点，探寻治疗新方向

这篇研究通过分析基因测序数据等多种方法，发现 S100 钙结合蛋白 A9（S100A9）在糖尿病足溃疡中高表达，且与伤口愈合时间正相关。S100A9 可能通过多条信号通路影响炎症反应和皮肤再上皮化，有望成为糖尿病足溃疡治疗的新靶点。

　　### 研究背景
糖尿病在全球范围内呈现高发态势，2021 年成人糖尿病全球患病率达 10.5%，约 5.366 亿人患病，北京地区预计到 2024 年成人糖尿病患病率将达 13.9%。糖尿病足是糖尿病患者致残致死的重要原因，每年全球约 1860 万人患糖尿病足溃疡，约 34% 的糖尿病患者一生中会经历足溃疡，20% 的患者需下肢截肢，且糖尿病足溃疡患者 5 年死亡率高达 30%，足部以上截肢患者死亡率更是超 70%。

糖尿病足与神经、血管损伤及高血糖引发的继发感染密切相关，但具体病理机制尚不明确，当前清创等治疗手段效果欠佳。随着基因测序技术发展，全基因组分析被广泛应用于寻找疾病关键基因和潜在治疗靶点。S100 钙结合蛋白 A9（S100A9）是由 114 个氨基酸组成的蛋白质，常与 S100A8 形成异二聚体和四聚体，在多种生理病理过程中发挥复杂作用，与炎症反应关系紧密，在肿瘤细胞增殖迁移、银屑病患者中均有相关表现，还参与调节肠道上皮细胞增殖。本研究旨在寻找糖尿病足溃疡的关键基因，验证其表达并探究其在溃疡愈合过程中的作用。

研究方法

1. 研究设计：从公共数据库检索基因测序数据，经生物信息分析找出糖尿病足的关键基因（hub gene）。收集糖尿病和非糖尿病患者的血液及组织样本，检测关键基因水平，同时检测相关炎症因子和通路蛋白。构建糖尿病小鼠模型，进一步探究关键基因在糖尿病足愈合过程中的作用。
2. 数据来源：从 GEO 数据库获取 GSE80178、GSE1334431 和 GSE68183 数据集，数据使用遵循相关政策和许可协议。
3. 差异基因表达和富集分析：运用 limma R 包和 RStudio 2022.02.2 软件，筛选差异表达基因（DEGs，P<0.05，log fold change>1）。借助 DAVID 工具进行基因本体（GO）分析，了解常见 DEGs 的功能；利用 KEGG Orthology-Based Annotation System KOBAS 3.0 工具开展京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。用 RStudio 绘制圆形图展示前 10 个显著功能，用弦图呈现前 5 个 GO 术语相关基因。
4. 蛋白质相互作用网络构建：利用 Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins 构建 DEGs 的蛋白质相互作用网络，通过 Cytoscape 软件可视化，将相互作用超 10 次的蛋白质及其对应基因确定为关键蛋白和基因。
5. 关键基因的识别：找出 GSE134431 和 GSE80178 中差异表达最高的 30 个 DEGs，与蛋白质相互作用网络中的关键基因以及 GSE68183 中的 DEGs 进行重叠分析，从而确定关键基因。
6. 样本采集：2023 年 5 月 4 日至 23 日在长海医院采集样本。糖尿病患者纳入标准为年龄＞18 岁、确诊糖尿病超 1 年且无严重或精神疾病；非糖尿病个体纳入标准为年龄＞18 岁、无糖尿病史，空腹血糖＜7.0 mmol/L，口服葡萄糖耐量试验 2 小时血糖＜11.1 mmol/L 且无严重或精神疾病。慢性伤口定义为 4 周未愈合伤口，排除急性创伤溃疡、急性烧伤溃疡及已接受治疗的伤口患者。每组确定 4 名参与者，均需手术治疗，采集慢性伤口区域全层皮肤样本、基本信息（年龄、性别、空腹血糖、糖化血红蛋白 A1c 浓度、伤口愈合时间）及血浆样本。研究获长征医院伦理委员会批准（No. 2024SL050），并取得所有参与者的知情同意。
7. 糖尿病小鼠模型建立和伤口愈合测试：建立糖尿病模型前，C57BL/6 小鼠禁食 12 小时。将链脲佐菌素（STZ）溶于柠檬酸钠缓冲液（pH 4.2 - 4.5）配成 10 mg/mL 溶液，糖尿病组小鼠按 150 mg/kg 腹腔注射，对照组注射等量缓冲液。3 天后尾尖采血测血糖，空腹血糖≥11.1 mmol/L 视为糖尿病模型建立成功。糖尿病小鼠每组 8 只，对照组 7 只。建模 3 周后麻醉小鼠，剃除腿部毛发，在每只小鼠腿部制造直径 0.5 cm 的圆形伤口。于第 0、3、7、10 天拍照记录伤口，用 ImageJ 计算伤口面积（第 0 天伤口面积设为 100%，其他时间点以与第 0 天面积的比值表示）。第 7 天处死半数小鼠，采集伤口周围皮肤组织用于后续分析。
8. 实时定量聚合酶链反应（PCR）：将小鼠皮肤组织研磨成粉，用 Trizol 试剂提取 RNA 并逆转录为 cDNA。在 48 孔板中配制实时定量 PCR 体系，含 1 μL cDNA 溶液、0.3 μL 10 μmol/L 引物对（S100A9 和 GAPDH 引物）、5 μL 实时荧光定量 PCR 扩增预混液，加无 RNA 酶水至 10 μL。离心混匀后进行实时定量 PCR，计算每个样本的循环阈值（CT）值。
9. 蛋白质免疫印迹法（Western blotting）：用 RIPA 裂解缓冲液提取患者和小鼠组织中的蛋白质，经电泳转移至膜上。膜依次与 S100A9 多克隆抗体、β- 肌动蛋白多克隆抗体、GAPDH 单克隆抗体、磷酸化蛋白激酶 B（p-Akt）多克隆抗体等多种一抗孵育，再与二抗孵育，用 High-sig ECL Western Blotting Substrate 显色，用 ImageJ 分析蛋白条带相对灰度值（与内参蛋白比较）。
10. 免疫组织化学和苏木精 - 伊红（H&E）染色：对临床患者组织切片进行二甲苯脱蜡、乙醇水化处理，微波抗原修复，用 5% H₂O₂溶液终止内源性过氧化物酶活性。用牛血清白蛋白封闭后，与 S100A9 一抗 4°C 孵育过夜，再与二抗孵育 2 小时。苏木精染色后，用二氨基联苯胺四氯化物显色 1 分钟，常规进行 H&E 染色。随机选取 10 个视野进行免疫组织化学染色分析阳性信号面积，随机选取 3 个位置测量 H&E 染色样本的表皮层厚度。
11. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：按照 ELISA 试剂盒（ref# CSB-E11833h，Cusabio）说明书进行操作。
12. 统计分析：使用 GraphPad Prism 8 软件分析数据，组间比较采用独立样本 t 检验，用 Pearson 线性相关分析评估伤口愈合时间与血浆 S100A9 水平的关系。数据以均值 ± 标准差表示，P<0.05 为差异有统计学意义。

研究结果

1. 糖尿病足溃疡相关差异表达基因和富集分析：对比 GSE80178 和 GSE134431 数据集的糖尿病足溃疡和糖尿病皮肤组织转录组，分别鉴定出 1805 个和 1086 个 DEGs，综合分析得到 283 个共享 DEGs（182 个上调，101 个下调）。GO 分析显示，最显著富集的术语包括角化、细胞外区域和细胞外空间。KEGG 通路富集分析表明，常见 DEGs 在角质化包膜形成和角化过程中显著富集。
2. 蛋白质相互作用网络整合：构建的蛋白质相互作用网络包含 215 个蛋白质和 615 个相互作用，排除 68 个未翻译或翻译后无相互作用的基因。
3. S100A9 作为糖尿病足关键上调基因的鉴定：综合分析多个数据集，确定 S100A9 和 KRT6C 为关键基因，其中 S100A9 在糖尿病和糖尿病足溃疡中高表达，且在蛋白质相互作用中起重要作用。
4. S100A9 在慢性糖尿病溃疡中的表达验证：Western blotting、免疫组织化学（IHC）染色和 ELISA 检测结果均显示，慢性糖尿病溃疡患者的 S100A9 表达显著高于非糖尿病对照组，且血浆 S100A9 水平与伤口愈合时间呈正相关。
5. 慢性糖尿病溃疡中的炎症因子、表皮厚度和通路蛋白：糖尿病组慢性溃疡中肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）、白细胞介素 - 1（IL-1）和白细胞介素 - 6（IL-6）等炎症因子水平显著高于对照组，H&E 染色显示糖尿病慢性溃疡表皮层明显更薄，Western blotting 结果也证实了这一趋势，且糖尿病慢性溃疡组中 p-ERK、p-p38、p-p65 和 p-Akt 水平升高。
6. 糖尿病小鼠皮肤中 S100A9 的表达：与非糖尿病小鼠相比，糖尿病小鼠体重显著降低，空腹血糖显著升高，伤口愈合较慢，伤口皮肤组织中 S100A9 和炎症因子（TNF-α、IL-1、IL-6）水平更高。

研究讨论

糖尿病足具有发病率高、病程长、复发率高、治疗效果差及致死致残率高的特点，给社会带来沉重负担。目前其分子机制尚未完全明确，治疗手段有限。本研究通过分析多个数据集，结合多种生物信息学方法，确定 S100A9 为糖尿病足溃疡的关键基因。

S100A9 在慢性糖尿病溃疡中高表达，动物实验也证实其在糖尿病小鼠伤口皮肤中高表达，且血浆 S100A9 水平与伤口愈合时间正相关，表明其在伤口愈合中起关键作用。糖尿病通过复杂机制影响伤口愈合，高血糖抑制角质形成细胞和成纤维细胞的增殖迁移，破坏糖尿病足溃疡中与再上皮化相关的角质形成细胞蛋白，伤口床大量促炎细胞因子持续放大炎症反应，不利于伤口愈合。研究发现 S100A9 与糖尿病慢性溃疡中炎症因子水平升高、表皮层变薄有关，提示其可能加剧局部炎症反应，阻碍再上皮化。

Toll 样受体 4 和晚期糖基化终产物受体是 S100A9 的主要受体，其下游通路在肿瘤、自身免疫疾病及糖尿病并发症研究中已得到证实。本研究发现 S100A9 表达与慢性糖尿病溃疡中 p-ERK、p-p38、p-p65 和 p-Akt 表达正相关，S100A9 可能通过这些通路影响炎症反应、细胞增殖分化、凋亡和血管生成，进而影响糖尿病伤口愈合，但具体机制仍有待进一步探究。

本研究证实 S100A9 在慢性糖尿病溃疡和糖尿病患者血浆中显著升高，与伤口愈合时间相关，且伴随炎症因子和相关通路蛋白水平变化以及表皮层厚度改变。S100A9 可能通过 MAPK-ERK/p38、NF-κB 和 PI3K-Akt 通路调节局部炎症反应和皮肤再上皮化，促进糖尿病溃疡发生。深入研究 S100A9 参与糖尿病溃疡发病机制的具体过程，有望为糖尿病足溃疡治疗提供新的分子靶点。