探究水通道蛋白过表达细胞低温保存中冷却速率的关键作用 —— 为优化冷冻保存技术开辟新路径

为解决细胞低温保存中脱水时机、合适脱水量及冷冻过程机制不明的问题，研究人员以水通道蛋白 4（AQP4）过表达细胞为对象，添加不同冷冻保护剂（CPA）进行低温保存实验。结果表明无 CPA 无法成功冻存细胞，不同冷却速率下 CPA 效果各异。该研究有助于改进低温保存方法。

　　在生命科学领域，细胞低温保存（cryopreservation）是一项极为重要的技术，它就像是为细胞打造的 “时光胶囊”，能让细胞在低温环境下 “暂停生长”，实现长期储存，为后续的医学研究、临床治疗等提供宝贵的细胞资源。然而，这个 “时光胶囊” 技术却存在着一些棘手的问题。

细胞经过冷冻再解冻后，其活力往往会大打折扣，这主要和细胞内冰晶的形成有关。当细胞内形成冰晶时，就如同在细胞内部埋下了一颗颗 “小炸弹”，会对细胞膜等结构造成破坏。目前已知，细胞内水的脱水情况在低温保存中起着关键作用。在缓慢冷冻过程中，细胞外的水先结冰，细胞内外形成溶质浓度差，细胞内的水会外流，从而抑制细胞内结冰，但细胞外高浓度的溶液又可能会对细胞造成损伤。而在快速冷冻时，细胞内会出现过冷现象和细胞内冰晶形成（intracellular ice-crystal formation，IIF），同样会导致细胞受损。这就是著名的 Mazur 的 “两因素假说”，即细胞内结冰和细胞内溶质积聚分别是快速和缓慢冷却条件下细胞损伤的原因。但问题在于，细胞内水脱水的时机和合适的脱水量并不明确，冷冻过程的详细机制也尚未完全清楚。

冷冻保护剂（Cryoprotectant agents，CPAs）常被用于提高细胞冷冻后的活力。二甲基亚砜（Me₂SO）是常用的 CPA，但它对细胞有毒性，在临床应用中可能会引发严重的副作用。于是，研究人员把目光投向了其他物质，比如海藻糖（trehalose），它是一种二糖，分子较大不能透过细胞膜，可通过海藻糖转运蛋白进入细胞，有望成为替代 Me₂SO 的 CPA。

在这样的背景下，为了深入探究细胞低温保存中的脱水问题，来自未知研究机构的研究人员开展了相关研究。他们以过表达水通道蛋白 4（Aquaporins 4，AQP4）的细胞为研究对象，AQP4 是一种水通道蛋白，能增加细胞膜的水通透性。研究人员在不同冷却速率下，分别添加 Me₂SO、海藻糖或不添加 CPA，对过表达 AQP4 的细胞和未过表达 AQP4 的细胞进行低温保存实验，以此来研究细胞在冷却过程中脱水的时间点，以及脱水对细胞活力的提升程度。

该研究中用到的主要关键技术方法包括：建立稳定表达 AQP4 不同亚型（AQP4M1 和 AQP4M23）的中国仓鼠卵巢细胞（CHO 细胞）系及对照细胞系，这是实验的细胞来源基础；在不同冷却速率下对细胞进行冷冻保存操作，通过控制冷却速率来模拟不同的冷冻条件；检测冷冻解冻后细胞的活力，以此作为衡量冷冻保存效果的关键指标 。

下面来看具体的研究结果：

• 冷却速率对添加 Me₂SO 冻存细胞活力的影响：研究人员首先测量了添加 10% Me₂SO 冻存细胞的冻融活力与冷却速率的关系。结果发现，在没有 Me₂SO 的情况下，无论冷却速率如何，细胞活力都低于 10%，这表明在该冷却速率范围内，不使用 CPAs 无法成功冻存 CHO 细胞，即使细胞过表达 AQP4 也不行。
• 不同冷却速率下添加不同 CPA 对细胞活力的影响：在冷却速率低于 35°C/min 时，添加 Me₂SO 的细胞活力随着冷却速率的降低而保持稳定，而添加海藻糖的细胞活力却下降了。当冷却速率高于 80°C/min 时，过表达 AQP4 的细胞活力显著高于未过表达 AQP4 的细胞。

综合上述研究结果，研究人员得出结论：不使用 CPAs 无法实现细胞的有效低温保存。并且发现细胞外冷冻后产生的渗透压导致的脱水对细胞是致命的。

这项研究有着重要的意义。它首次明确了仅仅增加细胞膜的水通透性（如过表达 AQP4），在没有 CPAs 的情况下，无法提高细胞低温保存的效果。研究结果为深入理解细胞低温保存的机制提供了关键信息，有助于改进已经沿用了半个多世纪的低温保存方法，还可能增加能够被成功低温保存的细胞类型，为生命科学研究和临床应用中的细胞保存技术发展提供了新的思路和方向。该研究成果发表在《Cryobiology》上，为该领域的进一步研究奠定了坚实的基础。