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为解决细胞表面靶点表达分析中校准依赖、结果不确定性等问题，研究人员开展了利用流式细胞术结合数学模型分析单克隆抗体（mAb）结合动力学的研究。结果表明该方法可同时估计 Ab 结合能力（ABC）和 mAb 结合解离速率，对药物研发意义重大。
在生物治疗领域，细胞表面的膜蛋白常常是抗体（Abs）等生物治疗分子的关键作用靶点。膜靶点的丰度变化可作为疾病进展或治疗效果评估的生物标志物，而足够的细胞表面靶点密度更是决定 CAR-T 细胞疗效的关键因素 。因此，精准量化细胞表面靶点水平对开发高效疗法极为重要。
目前，流式细胞术是检测细胞靶点表达的常用方法，它通过荧光标记的单克隆抗体（mAb）与细胞孵育至结合平衡，再借助已知荧光团数量的参考标准品（如 BD Quantibrite Phycoerythrin（PE） beads）来校准，从而确定膜结合抗体分子的绝对数量，即抗体结合能力（ABC）。然而，这种校准依赖的方法存在诸多问题。一方面，对于非 PE 荧光团标记的 mAb，校准品的精度较差，容易导致结果偏差；另一方面，多数市售试剂中 mAb 与荧光团的结合比例未知，却在 ABC 计算中默认 1:1 的等摩尔比，这无疑给计算引入了不确定性。此外，获取特殊校准试剂耗时费力，限制了实验的开展。因此，开发一种更可靠、高效的细胞表面靶点水平分析方法迫在眉睫。
为解决这些问题，来自美国辉瑞公司（Pfizer Inc.）等机构的研究人员展开了深入研究。他们提出了一种基于流式细胞术测量 mAb 结合动力学，并结合数学模型分析的新方法，相关成果发表在《AAPS Open》杂志上。
在研究方法上，研究人员主要运用了以下关键技术：
一是流式细胞术。该技术用于测量 mAb 与细胞结合过程中的荧光信号变化，包括平衡结合和结合动力学的检测。通过流式细胞仪对不同时间点、不同 mAb 浓度下细胞的荧光强度进行测定，获取大量数据。
二是数学建模。采用基于普通微分方程的数学模型，结合非线性混合效应（NLME）方法，对 mAb 与细胞表面靶点的结合过程进行建模。该模型可描述 mAb 与靶点的结合（kon）和解离（koff）动力学，同时估计 ABC、kon、koff和细胞表面亲和力（Kd）等关键参数。
研究结果主要如下：
- 方法开发：HL-60 细胞中 CD33-PE mAb 的动力学结合分析：研究人员以 CD33-PE mAb 与表达 CD33 靶点的 HL-60 细胞为研究对象，分别运用传统的平衡结合法和新开发的动力学结合法进行研究。平衡结合法确定的 CD33 ABC 基准值为1.9×104?2.1×104，细胞表面Kd为0.4?1.1nM；动力学结合法估算的 ABC 为2.7×104?6.9×104，Kd为0.2?0.5nM。模型估算值与基准值在两倍范围内，表明新方法具有可行性。
- 方法性能评估 I：Ramos 细胞中 CD20 mAb - 荧光团结合物的动力学结合分析：选用与不同荧光团（PE、FITC、APC）结合的 CD20 mAb，在表达 CD20 靶点的 Ramos 细胞中进行实验。结果显示，对于 CD20-PE mAb，模型预测的 ABC 与基准测量值相近；但对于 CD20-APC 和 CD20-FITC mAb，ABC 估算对模型初始参数敏感，不过模型仍能有效识别不同荧光团结合 mAb 的结合亲和力。
- 方法性能评估 II：Daudi 细胞中 CD38 mAb - 荧光团结合物的动力学结合分析：研究人员使用与 PE、FITC、APC 结合的 CD38 mAb，在表达 CD38 靶点的 Daudi 细胞中进行实验。对于 CD38-PE mAb，模型估算的 ABC 与基准值相符；CD38-APC mAb 的 ABC 估算对模型初始参数敏感；而 CD38-FITC mAb 的 ABC 估算值比其他形式低 3 - 10 倍，且置信度低。此外，模型估算的 CD38 mAb 的Kd值与基准测量值存在差异，这可能与抗体结合化学计量或细胞表面亲和力有关。
研究结论和讨论部分指出，该研究提出的无需校准的方法，可同时表征膜靶点表达和 mAb 细胞结合速率。在不同细胞系统中，对于已知荧光团结合比例的 mAb，该方法能可靠地确定膜靶点水平。但对于荧光团结合比例未知的 mAb，ABC 估算可能对模型初始化敏感。同时，在分析抗体与细胞结合动力学时，高表达的靶点可能影响Kd预测，未来的数学模型优化可考虑更复杂的抗体 - 靶点相互作用场景。总体而言，该研究为药物研发提供了一种新的定量分析方法，有助于在更接近生理条件下研究抗体与靶点的结合特性，加速药物研发进程。
