基于 DNA 适配体的伪狂犬病病毒（PRV）检测新方法：高敏、特异且便捷

为解决伪狂犬病病毒（PRV）现有检测方法复杂、昂贵、耗时等问题，河南农业大学研究人员开展针对 PRV 糖蛋白 D（gD）的 DNA 适配体研究。他们开发出 Apt-gD-2 适配体及 ic-ELASA 检测方法，与 qPCR 一致性达 83.3%，为猪业疾病防控提供有力工具。

　　伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV），也叫猪疱疹病毒 1 型（SuidAlphaherpesvirus 1），给全球养猪业带来了巨大的经济损失。它就像一个隐藏在猪群中的 “杀手”，传染性极强。仔猪感染后，会出现致命的中枢神经系统紊乱；成年猪则会出现呼吸道症状；怀孕母猪更惨，可能会流产。而且，PRV 的 “作恶范围” 还不止于猪，牛羊、猫狗，甚至貂、狐狸等动物都可能被它感染，更可怕的是，它还有感染农场工人的记录，具有潜在的人畜共患风险。

目前，PRV 的诊断方法虽然不少，像病毒分离，它被视为检测的 “金标准”，特异性高，能检测出活病毒粒子；PCR 和 RT-PCR 也常用于快速检测，还能区分野生型和疫苗株。但这些方法都有各自的 “短板”，病毒分离耗时太长，PCR 和 RT-PCR 不仅需要昂贵的设备，操作也很复杂，这使得它们很难在养猪场广泛应用。所以，寻找一种更高效、更经济的 PRV 检测方法迫在眉睫。

在这样的背景下，河南农业大学的研究人员挺身而出，开展了一项意义重大的研究。他们把目标锁定在 PRV 的糖蛋白 D（glycoprotein D，gD）上，试图开发出针对 gD 的 DNA 适配体，进而建立一种新的检测方法。最终，他们成功开发出了具有高亲和力和特异性的 DNA 适配体 Apt-gD-2，并基于此建立了间接竞争酶联适配体吸附试验（ic-ELASA）。这一成果意义非凡，为 PRV 的快速、灵敏、现场检测提供了新的有力工具，有望助力养猪业更好地防控伪狂犬病。该研究成果发表在《Animal Diseases》杂志上。

研究人员为开展这项研究，主要用到了以下几种关键技术方法：

1. 原核表达与纯化技术：将优化后的 gD 基因克隆到 pET21b-His-MBP 载体，在大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞中诱导表达重组 MBP-gD 蛋白，再通过 Ni-NTA 亲和层析进行纯化。
2. SELEX 筛选技术：利用磁珠法进行系统性进化配体指数富集技术（SELEX）筛选，经过 15 轮筛选，获得能特异性结合 gD 蛋白的 DNA 适配体。
3. 多种检测技术：采用酶联适配体吸附试验（ELASA）评估适配体与蛋白的结合能力；通过分子对接分析适配体与 gD 蛋白的相互作用机制；运用间接免疫荧光分析检测适配体与 PRV 病毒粒子的结合情况；使用 ic-ELASA 检测临床样本中的 PRV，并与 qPCR 进行对比。

下面来看看具体的研究结果：

1. 融合蛋白的纯化与鉴定：研究人员将 gD 蛋白的 1 - 284 氨基酸区域连接到 pET21b-His-MBP 载体，在原核表达系统中成功表达出重组蛋白 MBP-gD。经 SDS-PAGE 分析，在约 75kD 和 45kDa 处出现单一条带，证实了其纯度；Western blot 分析进一步确认，纯化的 MBP-gD 蛋白和 MBP 蛋白都能与 MBP 单克隆抗体结合，表明 MBP-gD 重组蛋白和 MBP 标签蛋白制备成功。
2. DNA 适配体的筛选：研究人员利用基于磁珠的 SELEX 方法筛选针对 gD 蛋白的 DNA 适配体。为增加 gD 蛋白的溶解性，在其 N 端融合了 MBP 标签，并在筛选过程中通过 MBP 标签蛋白进行负选，排除非特异性结合的适配体。经过 15 轮筛选，qPCR 和流式细胞术分析显示，随着筛选轮数增加，与 gD 蛋白结合的 DNA 适配体逐渐富集。最终选择重复频率最高的 Apt-gD-1 和 Apt-gD-2 作为候选适配体进行后续验证。
3. 适配体结合特性评估：ELASA 检测发现，Apt-gD-2 与 MBP-gD 蛋白的结合亲和力随适配体浓度增加而显著提高，而 Apt-gD-1 未检测到结合。进一步测定 Apt-gD-2 与 MBP-gD 的解离常数（K_d）为 6.107 ± 0.476 nM。特异性实验表明，Apt-gD-2 只与 MBP-gD 蛋白特异性结合，与其他蛋白无明显结合。二级结构分析显示，Apt-gD-2 形成稳定的茎环结构，分子对接分析揭示其与 gD 蛋白通过氢键相互作用。
4. 适配体与 PRV 病毒粒子结合检测：用生物素化的核酸适配体与纯化的 PRV、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）孵育，ELASA 和间接免疫荧光分析结果均表明，Apt-gD-2 能选择性地与 PRV 结合，对 PEDV 和 PRRSV 无明显结合，说明 Apt-gD-2 对 PRV 病毒粒子具有高度特异性。
5. ic-ELASA 检测 PRV：研究人员建立了 ic-ELASA 检测方法，通过测量 10 份 PRV 阴性组织样本的 OD₄₅₀值，计算得出临界值为 26.40%。特异性实验显示，只有 PRV 的抑制率（PI）值高于临界阈值，PEDV 和 PRRSV 低于该阈值，且该方法最低可检测到约 10⁴ TCID₅₀的 PRV，表明其特异性高、灵敏度强。对 30 份临床组织样本检测发现，ic-ELASA 与 qPCR 的总体符合率为 83.3% ，证明了 ic-ELASA 检测 PRV 的可靠性。

研究结论和讨论部分再次强调了该研究的重要意义。PRV 感染给养猪业带来的损失巨大，尽管现有疫苗能在一定程度上控制其传播，但变异毒株的出现削弱了疫苗的保护效果，早期诊断对于 PRV 的防控至关重要。ic-ELASA 检测方法具有成本效益高、操作简便、灵敏度高的优点，与 qPCR 相比，虽然 qPCR 灵敏度高，但操作复杂、耗时且需要专业人员，而 ic-ELASA 更适合在养猪场现场检测，是现有 PRV 检测方法的重要补充。这项研究为基于适配体的 PRV 诊断和防控开辟了新道路，有望为养猪业的健康发展提供有力保障。