新发现！金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中新型 MFS 外排泵的鉴定及特性研究：关乎耐药危机与健康防控

本文鉴定出金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）中一种新型主要易化超家族（MFS）外排泵 Nms。它可赋予细菌多药耐药性，与 ST398 等菌株关系密切，可能起源于质粒。该研究对了解耐药机制、防控耐药菌传播意义重大。

　　

研究背景

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种重要的革兰氏阳性病原菌，能引发人和动物的多种严重感染性疾病，如肺炎、心内膜炎和菌血症等。然而，其耐药问题日益严重，给全球公共卫生带来巨大挑战。外排泵在金黄色葡萄球菌的耐药过程中发挥着关键作用，它能将各种底物泵出细胞，降低细胞内药物浓度，导致多药耐药性的产生。此外，外排泵还参与细菌生物被膜的形成等过程，间接影响细菌的致病性。

在金黄色葡萄球菌中，已发现五个家族的外排泵，其中主要易化超家族（MFS）外排泵由 12 或 14 个跨膜片段（TMSs）和高度保守的氨基酸序列基序组成。MFS 外排泵的底物广泛，包括四环素、大环内酯类、喹诺酮类和氯霉素等多种抗菌药物，其功能活性对于理解金黄色葡萄球菌的耐药机制至关重要。而且，MFS 外排泵由可在菌株间转移的获得性抗生素耐药基因（ARGs）编码，这使得耐药性在葡萄球菌中传播，对食品安全和公共卫生构成威胁。此前研究发现一个假设的外排泵基因nms，本研究旨在深入探究其功能、流行情况和起源。

材料和方法

1. 菌株和常规培养：通过 GenBank 公共数据库扫描全球基因组，获取 42 株nms阳性菌株基因组，包括 37 株金黄色葡萄球菌和 5 株表皮葡萄球菌。同时，从 NCBI 数据库下载 193 个金黄色葡萄球菌 ST398 菌株基因组用于构建系统发育树。实验中，大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α 在 LB 肉汤中培养，金黄色葡萄球菌菌株在脑心浸液（BHI）肉汤或琼脂中培养，根据需要添加抗生素维持质粒。
2. 抗菌药敏试验：依据临床和实验室标准协会（CLSI）指南，采用肉汤微量稀释法测定抗菌药物的最低抑菌浓度（MICs）。对于 CLSI 指南中未包含的替加环素，参考欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）标准确定其折点。使用外排泵抑制剂（EPI）羰基氰氯苯腙（CCCP，终浓度 100 μM）评估外排活性对 MICs 的影响。
3. 基因克隆和电转化：以nms阳性菌株 GD4SA108 的基因组 DNA 为模板，扩增nms基因及其上游 320 bp 可能的启动子区域，将其克隆到穿梭载体 pLI50 中，构建 pLI50-Nms 质粒。选用不携带影响 Nms 功能实验的外排泵的金黄色葡萄球菌 RN4220 作为宿主菌，制备感受态细胞并进行电转化。通过 PCR 扩增和 Sanger 测序筛选并确认nms阳性电转化子。
4. 细胞内积累和外排活性测定：将过夜培养的菌株稀释后培养 6 小时以上，离心收集菌体，用含 10 mM 葡萄糖的磷酸盐缓冲液（PBS）重悬并调整 OD₆₀₀至约 0.6。在细胞内积累实验中，向细胞悬液中加入溴化乙锭（EtBr，终浓度 2 mg/L），每隔 10 分钟测量荧光强度（发射波长 580 nm，激发波长 500 nm）。在外排实验中，先将 EtBr 加入细胞悬液（终浓度 2 mg/L）孵育 1 小时，离心去除细胞外 EtBr，再测量荧光强度。外排抑制实验则在加入 EtBr 20 分钟后添加 CCCP（终浓度 100 μM）。
5. 生物被膜形成实验：将过夜培养的菌株以 1:200 的比例稀释到含 0.5% 葡萄糖的胰酪大豆胨肉汤（TSB）中，加入 96 孔板中，37°C 孵育 24 小时。孵育结束后，小心去除肉汤，用 PBS 洗涤 3 次，加入 0.1% 结晶紫染色 5 分钟，再次洗涤后，用酸化乙醇溶解染色的生物被膜，转移到新的 96 孔板中，立即测量 OD₆₀₀。
6. 生物信息学分析：运用 mlst 和 spaTyper 鉴定分子类型，利用 ABRicate v1.0.1 基于支持的数据库鉴定毒力因子（VFs）和 ARGs。在 ABRicate v1.0.1 中生成独特数据库，使用 blastn 扫描全球基因组数据检测nms基因。通过 Parsnp 构建nms阳性金黄色葡萄球菌菌株的核心基因组比对，用 RaxML 基于最大似然法（ML）和 GTRGAMMA 替代模型生成系统发育树。使用 Prokka v1.14.6 注释菌株的全基因组测序（WGS）数据，借助 Easyfig v2.2.5 推断基因组比较的线性图，在 IslandViewer 4 中预测基因组岛。同时，利用 TMHMM 2.0 预测 Nms 外排泵的 TMS，SWISS-MODEL 预测蛋白质三维结构，Protter v1.0 可视化 Nms 外排泵的拓扑结构，MEGA-X 基于邻接法（NJ）算法对包括nms在内的 MFS 外排泵氨基酸序列进行比对并生成系统发育树。

研究结果

1. 金黄色葡萄球菌中新型 MFS 外排泵基因的鉴定：在金黄色葡萄球菌分离株的基因组中，发现一个具有 MFS 典型基序（包含氨基酸 G (X)₃DK/RXGRR/K，即基序 A）的基因，该基因长度为 1,194 bp，编码一个 42.8 kDa 的蛋白质，预测其氨基酸序列形成 12 个 TMSs，符合 MFS 转运蛋白的基本结构。进一步拓扑分析表明基序 A 位于 TMS2 和 TMS3 之间的膜内环。基于这些证据，确定该基因为新型 MFS 转运蛋白基因，命名为nms，其编码产物为 Nms。系统发育分析显示，Nms 与 12-TMS 药物：H⁺反向转运体（DHA12）和 14-TMS 药物：H⁺反向转运体（DHA14）在同一分支，与 QacA 和 Mmr 相比，Nms 与它们的氨基酸序列同一性和相似性较低。
2. NMS 外排活性的验证：通过 EtBr 积累、EtBr 外排和生物被膜形成实验评估 Nms 外排泵的活性。积累实验结果显示，nms阳性菌株的荧光强度在 20 分钟后低于空白对照和nms阴性菌株，且在整个测量期间差异均具有统计学意义。外排实验中，添加 CCCP 前，nms阳性菌株与其他菌株的外排率相似；添加 CCCP 后，nms阳性菌株的外排活性受到抑制，荧光强度显著高于其他菌株。生物被膜形成实验表明，nms阳性菌株的生物被膜形成量比空白对照和nms阴性菌株增加约 20%，差异具有统计学意义。
3. Nms 赋予金黄色葡萄球菌多药耐药性：检测不同测试组对多种抗菌药物的敏感性，发现携带nms基因的菌株 RN4220-pLI50-Nms 对红霉素、替米考星、克林霉素、庆大霉素、阿米卡星、四环素、多西环素、米诺环素和泰妙菌素等九种药物的 MICs 相较于 RN4220-pLI50 增加了 4 - 256 倍，突破了八种药物的耐药折点和米诺环素的中介折点。添加 EPI CCCP 后，除红霉素外，受 Nms 影响的抗菌药物的 MICs 恢复到敏感折点以下。总体而言，编码 Nms 的菌株对林可酰胺类和四环素类药物的外排活性高于其他菌株。
4. nms阳性金黄色葡萄球菌的全球流行情况：筛选nms基因后，对 37 株金黄色葡萄球菌进行分析，发现nms基因最早于 2012 年在韩国的猪源样本中被检测到，2012 - 2021 年在两个大洲的四个国家均有流行。大部分菌株（86.49%，32/37）在中国分离得到，主要分布在东部和南部的八个省份。最常见的菌株类型是 ST398（94.59%，35/37），其中 64.86%（24/37）为spa型 t571。几乎所有菌株都分离自猪和与猪相关的环境，仅有两株分别来自中国台湾（2019 年）和韩国（2017 年）。系统发育分析发现，金黄色葡萄球菌 ST398 菌株与之前分离的 ST541 菌株不同，对 35 株 ST398 菌株构建详细的系统发育树，根据分离地点和时间定义了三个菌落群。nms阳性金黄色葡萄球菌 ST398 菌株携带多种 ARGs，可赋予对 β - 内酰胺类、氨基糖苷类、博来霉素、大环内酯类、四环素类、氯霉素类、林可酰胺类、磷霉素和恶唑烷酮类药物的耐药性，且所有菌株都检测到与金黄色葡萄球菌定植和感染相关的 VFs。
5. nms的遗传内容和可能起源：扩大基因组扫描范围后，在 5 株表皮葡萄球菌中鉴定出nms基因，该基因最早于 2007 年在加拿大的牛源表皮葡萄球菌中出现，阳性菌株为 ST570（3/5）和 ST1166（2/5）。对 193 株近 10 年分离的金黄色葡萄球菌 ST398 菌株基因组分析发现，nms阳性菌株单独形成一个分支，仅有两株分别来自韩国和巴西的菌株与之聚类。不同来源和国家的nms阳性菌株遗传内容高度相似，在金黄色葡萄球菌 GD4SA108 和 GD4SA159 的染色体中，nms基因上下游检测到多种 ARGs 和移动遗传元件（MGEs），它们位于整合基因组岛中。基因组岛中，IS₆家族常与nms基因同时出现，并介导含有多种耐药基因的环形中间体形成。此外，还检测到与质粒相关的 MGEs，与猪源金黄色葡萄球菌 SA7037 的质粒 pV7037 和人源流行金黄色葡萄球菌菌株的质粒 pUSA10 相似，且表皮葡萄球菌中nms基因的遗传内容与金黄色葡萄球菌上下游相似。

讨论

截至 2024 年 8 月，NCBI 数据库中已有 180 条 MFS 相关记录，但此前研究表明金黄色葡萄球菌基因组中的多药外排泵基因尚未完全鉴定。Nms 具有典型的 12 个 TMSs 和基序 A，根据 TMSs 数量和基序 A 的氨基酸残基，推断其为 MFS 的 DHA12 组成员。功能验证实验中，选用单拷贝穿梭载体 pLI50，EtBr 作为经典底物，CCCP 作为标准 EPI。实验结果与之前鉴定的另一种新型 MFS 外排泵类似，表明 Nms 具有外排活性。

Nms 促进生物被膜形成，这与其他外排泵基因的作用相似，且生物被膜形成增加了耐药性发展和 ARGs 转移的风险。抗菌药敏实验表明，Nms 可降低金黄色葡萄球菌对多种常用抗菌药物的敏感性，虽载体 pLI50 携带氯霉素耐药基因影响了部分结果，但仍能推断 Nms 对大环内酯类耐药有贡献。与其他已鉴定的 MFS 外排泵相比，Nms 似乎赋予更高程度的耐药性，但由于不同质粒在金黄色葡萄球菌染色体中的表达差异，难以完全量化评估。

全球基因组筛查发现，nms基因在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中均有出现，其中金黄色葡萄球菌 ST398 是nms阳性菌株中的优势类型。ST398 菌株具有高毒力和生物被膜形成能力，ST398 - t571 更是潜在的人畜共患病威胁，本研究中nms阳性 ST398 - t571 菌株中 MRSA 占比超过一半。系统发育重建显示，nms阳性菌株在 ST398 菌株中呈单系聚类，提示nms基因可能通过水平转移被 ST398 菌株获取。表皮葡萄球菌作为 ARGs 的储存库，可能是nms基因的潜在来源。nms基因位于由 IS₆元件（IS₂₅₇和 IS₄₃₁）侧翼的基因组岛中，这些元件可介导质粒 - 染色体整合，且在nms阳性菌株中发现与质粒相关的遗传内容，基于此推测nms基因起源于质粒，通过金黄色葡萄球菌不同菌株传播，尤其是 ST398 菌株通过克隆扩张促进了其传播。

结论

nms基因编码一种新型 MFS 外排泵 Nms，属于 DHA12 组。Nms 的底物<