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本文构建了梅毒螺旋体（Treponema pallidum）的基因组规模代谢模型 iTP251 及其酶约束版本 ec - iTP251。通过模型分析发现其利用乳酸摄取产 ATP 及甘油 - 3 - 磷酸脱氢酶（G3PD1）维持氧化还原平衡的代谢策略，为研究其生存机制和靶向治疗提供了重要依据。
### 引言
梅毒螺旋体（
Treponema pallidum subspecies
pallidum strain Nichols）是引发梅毒的病原体，由于其严格依赖人体宿主且极难在实验室条件下培养，对其代谢的研究面临诸多挑战。尽管其基因组测序已完成，但对其代谢如何影响致病性的研究仍受限制。早期体外培养梅毒螺旋体的尝试均未取得可持续成果，直至 2018 年改进的共培养系统出现，才促进了对其代谢能力的理解。然而，在梅毒螺旋体中应用合成生物学工具依旧困难，这阻碍了对其代谢和毒力机制的功能研究。
梅毒螺旋体缺乏完整的三羧酸（TCA）循环，主要依赖底物水平磷酸化和乙酸溢流代谢产生 ATP，但这无法解释其如何满足高运动性所需能量。此外，其通过 D - 乳酸脱氢酶（D - LDH）补充 ATP 生成的机制也引发了对其还原力再生方式的疑问。
为解决这些问题，研究人员采用基因组规模代谢模型（GEMs）。GEMs 可模拟和分析代谢网络，此前已在性传播疾病相关细菌研究中发挥重要作用，且能整合 “组学” 数据。研究人员构建了 iTP251 模型，经 MEMOTE 评估得分 92%，并通过与其他生物的基因 essentiality 数据对比验证了其可靠性。在此基础上，开发了酶约束 GEM（ecGEM）ec - iTP251，结合酶周转数和分子量信息，与蛋白质组学数据对比显示出高准确性，还能准确预测生长速率。
结果与讨论
- 代谢模型重建与优化：利用 KBase 平台和 NCBI RefSeq 的基因组数据构建了 iTP251 的初始草案，随后进行了广泛的手动优化。在中央碳代谢方面，用焦磷酸依赖的磷酸果糖激酶替代 ATP 依赖的磷酸果糖激酶，并排除磷酸转移酶系统（PTS），以适应梅毒螺旋体的能量需求。基于蛋白质组学数据进行靶向缺口填补，添加了包括核苷酸、脂质和氨基酸合成等关键反应，使模型能够模拟梅毒螺旋体在体内碳源上的生长。此外，确定了梅毒螺旋体的生物质方程和生长相关维护（GAM）、非生长相关维护（NGAM）值，最终 iTP251 包含 600 个反应、605 种代谢物和 251 个基因。经 MEMOTE 评估，模型整体质量高，各关键类别得分良好，FROG 分析也验证了其稳健性和可重复性。
- iTP251 的验证：通过对 iTP251 进行反应和基因 essentiality 分析来评估其预测准确性。单反应删除确定了 166 个关键反应，主要涉及嘧啶和嘌呤代谢途径，以及糖酵解和戊糖磷酸途径。在 251 个基因中，预测有 40 个（15.94%）对梅毒螺旋体生存至关重要。与大肠杆菌（Escherichia coli）和淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）的实验验证数据对比，iTP251 预测的关键基因与这两种生物的关键基因有较高的一致性，表明该模型能有效捕捉梅毒螺旋体的基本代谢功能。
- 酶约束 GEM 的开发与验证：在 iTP251 基础上开发了 ec - iTP251，整合了有基因 - 蛋白质 - 反应（GPR）关联反应的酶周转数（kcat）和分子量（MW）信息。利用 DLKcat 工具预测大部分 GPR 关联反应的kcat值，对其余反应通过蒙特卡罗模拟生成kcat样本，构建 100 个集成 ecGEMs，选择总细胞蛋白需求最低的模型作为代表。将 ec - iTP251 预测的酶分配与高分辨率蛋白质组学数据对比，中央碳途径中预测和观察到的分数蛋白质组分配的皮尔逊相关性很强（R2 = 0.876），验证了模型的准确性。
- 不同底物的蛋白质组分配预测：利用 ec - iTP251 研究梅毒螺旋体在葡萄糖、丙酮酸和甘露糖三种碳源上的蛋白质组适应性。当以葡萄糖为唯一碳源时，大量蛋白质组资源分配给糖酵解酶；丙酮酸作为碳源时，蛋白质组资源向丙酮酸代谢和乙酸生成途径转移；甘露糖代谢则增加了对转运蛋白和特殊酶的分配。ec - iTP251 准确捕捉了实验观察到的葡萄糖和丙酮酸的生长速率，对甘露糖的生长速率预测也较为合理。这表明梅毒螺旋体在蛋白质组分配上具有灵活性，优先利用糖酵解和乙酸生成途径，以适应宿主环境。
- 能量生成与替代电子汇：ec - iTP251 模拟结果显示，梅毒螺旋体在利用三种碳源时均会同时摄取乳酸，这是一种额外的 ATP 生成策略。最大 - 最小驱动力（MDF）分析表明，乳酸摄取在热力学上比分泌不利，但能通过 TP_0037 催化的反应生成 ATP。由于梅毒螺旋体缺乏完整的 TCA 循环和功能电子传递链，研究人员寻找其在摄取乳酸时维持氧化还原平衡的机制。分析发现 16 个 NAD?再生反应，其中甘油 - 3 - 磷酸脱氢酶（gpsA编码，反应 ID：G3PD1）通量最高，是关键的替代电子汇。G3PD1 催化甘油 - 3 - 磷酸转化为二羟基丙酮磷酸，同时将 NADH 氧化为 NAD?，支持乳酸摄取、促进 ATP 生成和维持氧化还原平衡。这种利用 G3PD1 作为替代电子汇的策略在其他生物中也存在，体现了其在维持 NAD?再生方面的保守性。在梅毒螺旋体中，依赖 G3PD1 在热力学有利范围内维持氧化还原平衡，对其在宿主环境中的生存至关重要，也为潜在治疗靶点的研究提供了方向。
材料与方法
- 基因组规模代谢模型重建与优化：使用 KBase 平台生成梅毒螺旋体基因组规模代谢模型的初始草案，针对中央碳代谢进行手动优化，如调整糖酵解和能量守恒反应，去除 PTS 反应。基于蛋白质组学数据进行靶向缺口填补，添加与核苷酸、脂质、氨基酸、辅因子和能量代谢相关的反应，同时添加 D - 乳酸脱氢酶以代表产乙酸 ATP 生成途径。最后，测试模型对已知碳源的生长支持能力，确保模型的生物学准确性。
- 生物质组成和维护参数：参考伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）的代谢模型确定梅毒螺旋体的生物质组成，定义为 70% 蛋白质、20% 脂质和 5% 碳水化合物，并标准化生物质方程使其分子量为 1 g/mmol。利用 Pirt 方程计算 GAM 和 NGAM 值，GAM 通过通量平衡模拟迭代校准，NGAM 通过在 ec - iTP251 模型中模拟零生长条件确定，最终将这两个值作为固定参数纳入模型。
- 计算机模拟反应和基因 essentiality 分析：使用 COBRApy 工具包进行反应和基因 essentiality 分析，通过模拟单反应和单基因敲除确定关键反应和基因。将 iTP251 模型的预测结果与大肠杆菌和淋病奈瑟菌的实验验证数据进行跨物种验证，利用 BLAST 工具识别直系同源基因，评估模型对梅毒螺旋体基本代谢功能的预测能力。
- 酶约束模型开发和酶动力学整合：开发 ec - iTP251 模型，利用 DLKcat 工具预测大部分 GPR 关联反应的kcat值，计算酶的分子量。对缺乏kcat数据的反应，通过蒙特卡罗模拟生成 100 组kcat值，构建 100 个集成模型。计算每个模型的总细胞蛋白需求，选择需求最低的模型作为最具生物学相关性的模型。
- 与蛋白质组学数据验证：将 ec - iTP251 模型预测的蛋白质分配与高分辨率蛋白质组学数据集进行比较，计算中央碳途径中每个酶相关反应的分数蛋白质分配，对预测值和实验值进行对数转换后，使用皮尔逊相关系数（R）和决定系数（R2）评估模型预测的准确性。
- 最大 - 最小驱动力分析：应用 MDF 分析评估乳酸摄取和分泌的热力学可行性和驱动力。MDF 通过优化代谢途径中所有反应的最小吉布斯自由能耗散，确定维持通量方向性所需的最小驱动力。利用 eQuilibrator API 获取标准吉布斯自由能，设定代谢物浓度范围，分别对乳酸摄取和分泌条件进行优化，比较两者的热力学驱动力。
- 蛋白质约束下的底物特异性代谢优化：使用 ec - iTP251 模型对不同碳源进行底物特异性代谢优化，确定蛋白质限制条件下参与 ATP 生成和 NAD?再生的反应。针对每种碳源设定特定约束，如固定生物质生产通量和总细胞蛋白含量，分两步进行优化。首先，在满足生物质生产需求的同时最小化总蛋白质分配；然后，进行简约通量平衡分析，在固定蛋白质约束下最小化酶的使用，分析通量分布以确定底物特异性差异。
- 软件和计算工具：所有计算分析使用 Python，借助 COBRApy 0.29.0 包进行基于约束的建模，DLKcat 工具预测kcat值，MEMOTE 评估模型质量和一致性。计算在 Windows 11 Enterprise 操作系统上进行，硬件配置为 12th Gen Intel Core i7 - 12700H CPU、32.0 GB RAM 和 64 位 x64 - 基处理器。
综上所述，本研究通过构建和分析梅毒螺旋体的代谢模型，揭示了其独特的代谢适应策略，为深入了解梅毒螺旋体的生存机制和开发潜在治疗靶点提供了重要基础。未来研究可进一步验证甘油 - 3 - 磷酸脱氢酶作为治疗靶点的可行性，为对抗梅毒提供新的策略。
