编辑推荐：
这篇研究利用生物信息学技术预测布鲁氏菌（Brucella）外膜蛋白免疫原性表位，设计多表位融合蛋白。通过间接酶联免疫吸附试验（iELISA）评估其诊断性能，发现该融合蛋白在降低交叉反应性上表现出色，为布鲁氏菌病诊断提供新方向。
### 1. 引言
布鲁氏菌（Brucella）是一种革兰氏阴性、兼性厌氧细菌，能引发人畜共患的超敏性传染病 —— 布鲁氏菌病。全球超 170 个国家和地区有人类布鲁氏菌病病例报告，每年新增约 50 万例，中国病例数也在逐年攀升，2023 年超 7 万例。易感动物广泛，包括牛羊等。牲畜患病会出现流产等生殖问题，人类主要经皮肤黏膜、消化道和呼吸道感染，症状多样，易被误诊，所以建立精准诊断方法极为关键。
目前布鲁氏菌病诊断方法有细菌学、分子生物学和血清学诊断。细菌分离培养是 “金标准”，但检测率低、操作复杂且有安全风险；分子生物学技术（如 PCR、LAMP）虽灵敏度高、特异性强，但易受污染出现假阳性；血清学诊断中的凝集试验灵敏度和特异性较低，酶联免疫吸附试验（ELISA）虽有优势，但传统抗原（如脂多糖 LPS）易产生交叉反应，因此寻找新诊断抗原意义重大。
随着基因工程发展，融合蛋白技术可构建表达多功能蛋白。布鲁氏菌外膜蛋白免疫原性良好，如 OMP10、OMP16 等。生物信息学分析能加速疫苗设计等进程，多种 B 细胞表位预测工具涌现，本研究综合利用这些工具预测布鲁氏菌外膜蛋白 B 细胞抗原表位，构建融合蛋白，开发新 iELISA 方法。
2. 材料和方法
2.1 血清样本
徐州疾病预防控制中心提供 100 份经标准凝集试验（SAT）确认的布鲁氏菌阳性血清样本和 96 份阴性血清样本，均采集于 2022 年 1 月至 2023 年 11 月，并用商用 SAT 试剂盒检测。吉林大学第一附属医院提供 40 份非布鲁氏菌感染患者血清样本，用于交叉反应性验证。
2.2 融合蛋白的制备
首先，通过查阅 PubMed 数据库文献，选择在羊种布鲁氏菌（B. ovis）、牛种布鲁氏菌（B. abortus）和猪种布鲁氏菌（B. suis）中常见且保守的外膜蛋白，从 NCBI Protein 数据库获取其氨基酸序列，用 BLAST 工具对比，确定保守氨基酸序列。然后，利用 ABCpred、SVMTriP、BCPreds 和 Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0 这 4 种工具预测 B 细胞表位，并结合 IEDB 数据库中已验证的 B 细胞表位，提高预测准确性。
将预测的抗原表位用 “GGGS” 连接形成融合蛋白氨基酸序列，反向翻译为密码子并优化，在 3’端添加 His 标签，由生物技术公司合成编码基因并构建融合蛋白表达质粒（pET30a），通过原核表达制备融合蛋白。
融合蛋白纯化采用镍亲和层析法。用低压力色谱系统，将上清液以 0.5 mL/min 流速上样到预平衡的 Ni - IDA - Sepharose CL - 6B 亲和柱，用 Ni - IDA Binding Buffer 洗涤至洗脱液 OD280达基线，再用 Ni - IDA Washing Buffer 以 1 mL/min 流速洗涤至基线，最后用 Ni - IDA Elution Buffer 洗脱收集目标蛋白，透析重折叠后用 PBS 透析保存，用 12% SDS - PAGE 分析蛋白纯度。
2.3 间接 ELISA 方法的建立和评估
将纯化的布鲁氏菌多表位融合蛋白稀释至 10 μg/mL，每孔 100 μL 包被 96 孔微孔板，4°C 孵育过夜。洗涤后用 5% 脱脂牛奶 300 μL / 孔 37°C 封闭 2 小时，再次洗涤后加入 1:400 稀释的人血清抗体 100 μL / 孔，37°C 孵育 1 小时。洗涤后加 HRP 标记的兔抗人 IgG（1:10,000 稀释）100 μL / 孔，37°C 孵育 1 小时，洗涤后加 TMB 底物溶液室温避光显色 10 分钟，加 2 M H?SO? 50 μL / 孔终止反应，用酶标仪读取 OD450值。以 LPS 为对照抗原，相同条件下对血清样本进行检测，每个样本重复 3 孔，用平均 OD450值进行 ROC 曲线分析，根据 Youden 指数确定间接 ELISA 方法的灵敏度、特异性等指标。
2.4 交叉反应性评估
用构建的 iELISA 检测其他病原体感染个体血清评估交叉反应性，检测步骤同上，根据 ROC 曲线分析确定的临界值评估 OD450值判断交叉反应性。
2.5 统计方法
每个样本 OD450值重复测量 3 次，计算平均值用于 ROC 曲线分析。用 IBM SPSS 24.0 软件进行独立样本 t 检验评估阳性和阴性样本差异，P<0.05 为差异有统计学意义。用 GraphPad Prism 9.5.0 软件进行 ROC 曲线分析和绘制散点图。
2.6 伦理审批声明
研究经徐州医科大学伦理委员会审查批准（批准号：xzhmu - 20240201），因样本匿名处理未获取正式知情同意。
3. 结果
3.1 B 细胞表位预测
筛选出 8 种外膜蛋白作为候选靶点，共预测出 31 个表位，这些表位连接形成融合蛋白氨基酸序列。
3.2 融合蛋白的制备
原核表达后，目标蛋白在上清液中被检测到，纯化后融合蛋白纯度达 90.1%。
3.3 I - ELISA 检测布鲁氏菌效果评估
对四组血清进行非配对 t 检验，差异有统计学意义。ROC 曲线分析显示，融合蛋白诊断曲线下面积（AUC）为 0.9594（95% CI，0.9313 - 0.9874），LPS 的 AUC 为 0.9999（95% CI，0.9995 - 1.000），二者均有良好诊断价值。根据 Youden 指数，融合蛋白诊断临界值为 0.2774，此时灵敏度为 0.9063（95% CI，0.8313 - 0.9499），特异性为 0.9400（95% CI，0.8752 - 0.9722）；LPS 诊断临界值为 0.1953，灵敏度为 1.0000（95% CI，0.9615 - 1.0000），特异性为 0.9900（95% CI，0.9455 - 0.9995）。
3.4 交叉反应性评估
用 iELISA 检测，融合蛋白在 40 份非布鲁氏菌感染发热患者血清样本中有 8 份（20.0%）出现交叉反应，涉及多种细菌；LPS 有 16 份（40.0%）出现交叉反应，涉及大肠杆菌等多种细菌。
4. 讨论
布鲁氏菌病在中国是重点防控的人畜共患病，症状复杂，误诊易发展为慢性病并引发严重并发症。目前多数布鲁氏菌检测试剂盒基于 LPS，但获取 LPS 对实验室条件要求高，且 LPS 易与多种细菌产生交叉反应，降低诊断特异性，寻找替代抗原至关重要。
布鲁氏菌外膜蛋白免疫原性强，是潜在的亚单位疫苗和诊断抗原候选物。如 BP26 在多种动物和人体免疫反应良好；Omp10 在羊中有反应，可用于分型诊断；Omp16 可用于疫苗开发等。这些蛋白与部分细菌有一定交叉反应，但与大肠杆菌 O157:H7 和小肠结肠炎耶尔森菌 O9 无交叉反应。
本研究用融合蛋白作为诊断抗原，检测发现阳性血清检测融合蛋白的 OD450值低于 LPS，阴性血清则相反，可能影响融合蛋白检测准确性。不过，融合蛋白与 LPS 灵敏度相当，且多表位融合蛋白交叉反应性更低，生产过程更安全便捷，避免了 LPS 制备的风险和复杂要求。但融合蛋白交叉反应仍较严重，可能与纯化度仅 90.1% 有关，后续需进一步纯化。
本研究利用生物信息学和融合蛋白技术开发了布鲁氏菌病血清学检测新抗原，理论上特异性和灵敏度良好，但存在局限。样本人口统计学信息不明确，仅选取血清学阳性样本，样本量有限且局限于单一地区，后续需扩大样本收集范围验证融合蛋白检测效果。
