工程化上皮曲率调控肠道类器官中潘氏细胞的定位：开启肠道研究与治疗新篇

这篇论文利用光降解水凝胶（PEG hydrogels）构建肠道类器官隐窝模型，发现上皮曲率能调控潘氏细胞（PCs）定位。该研究为深入理解肠道类器官发育机制提供依据，有望推动疾病研究、药物筛选及组织工程等领域发展，值得关注。

　　### 研究背景
肠道类器官（Intestinal organoids）是由干细胞形成的三维多细胞结构，能模拟肠道的关键结构和功能，在发育研究、疾病进展研究、微生物组相互作用研究以及移植和药物筛选等方面具有重要价值。其突出特征是会形成类似隐窝的结构，在这个过程中，肠道干细胞（ISCs）会分化为分泌性的潘氏细胞（PCs），PCs 能提供生化信号建立隐窝微环境。

在正常生理状态下，ISCs 和 PCs 在隐窝内的正确组织对于调节肠道细胞动态和功能至关重要。然而，目前类器官的培养依赖于基底膜提取物如基质胶（Matrigel），但 Matrigel 成分复杂且多变，导致类器官结构和功能存在异质性，这给跨研究比较带来困难。为解决这一问题，研究人员尝试使用具有明确和可控材料特性的水凝胶来塑造肠道类器官的形态，不过，对于隐窝结构的可控形态如何影响类器官功能，尤其是 ISCs 和 PCs 的组织和定位，仍有待探究。

研究目的

本研究旨在开发一个平台，实现对肠道类器官模型中细胞组织的用户定向控制，为工程化功能性类器官行为提供可能。具体来说，就是探究通过控制隐窝结构的形态，特别是上皮曲率，能否影响 PCs 的组织和定位。

研究方法

1. 材料制备：合成了两种功能性聚乙二醇（PEG）大分子单体，即二苯并环辛炔（DBCO）功能化的 PEG（PEG 8 DBCO）和叠氮硝基苄基醚（N₃）功能化的 PEG（PEG 8 NBA），通过应变促进的叠氮 - 炔环加成（SPAAC）反应形成水凝胶。这种水凝胶平台不包含细胞响应性交联，其降解可通过用户定义的光照进行控制。
2. 隐窝分离与类器官培养：从 Defa4^Cre; Rosa26^tdTomato小鼠的空肠中分离隐窝，并在含有多种生长因子和补充剂的培养基中培养类器官。
3. 类器官封装与光图案化：将类器官菌落封装在光降解水凝胶中，利用激光扫描共聚焦显微镜对水凝胶进行光图案化处理。通过照射特定区域，使水凝胶中的硝基苄基醚交联键断裂，形成软化通道，引导隐窝的出芽和生长。
4. 检测与分析：使用免疫组织化学方法对肠道切片进行染色，分析 PCs 的分布和数量；通过对类器官进行免疫荧光染色，结合成像技术，测量隐窝的宽度、长度和间距等形态参数；运用傅里叶级数表示类器官的几何形状，并计算上皮曲率；通过跟踪 PC 特异性荧光报告基因（Defa4^Cre; Rosa26^tdTomato）的表达，实时监测 PCs 的形成和定位。

研究结果

1. 体内外隐窝形态差异：对小鼠肠道组织和 Matrigel 培养的类器官隐窝进行分析，发现体内隐窝在形态特征和 PCs 定位上更均匀，而 Matrigel 培养的类器官隐窝在隐窝长度、宽度和间距上存在更大的多分散性。体内隐窝主要由无曲率的大区域（对应于相对直的转运扩增（TA）区）和小部分高曲率区域（位于隐窝底部）组成；Matrigel 培养的类器官隐窝则更呈球状，无曲率区域较小，中等曲率区域较大。
2. 光图案化对隐窝形态的影响：通过改变光图案化区域的尺寸，能够精确控制形成的隐窝的宽度和长度。光图案化形成的隐窝宽度变化较小，且与 Matrigel 培养的隐窝相比，更接近体内隐窝的尺寸范围。此外，不同宽度的光图案在隐窝发育过程中会产生不同的上皮曲率变化。较窄的光图案（30μm）形成的隐窝曲率分布最终会形成双峰分布，而较宽的光图案（60μm）形成的隐窝曲率分布则保持单峰分布。
3. 上皮曲率对 PCs 定位的影响：研究发现，PCs 在较窄（30μm）光图案形成的隐窝中出现的时间更早。较宽的隐窝中 PCs 的数量更多，且 PCs 的定位与隐窝的曲率密切相关。在 30μm 光图案形成的隐窝中，更多的 PCs 出现在负曲率和高曲率区域；在 60μm 光图案形成的隐窝中，PCs 主要集中在中等曲率区域。通过应用梯形光图案，进一步证实了工程化上皮曲率可以调节 PCs 的密度和空间分布。

研究结论

本研究利用光降解水凝胶平台，成功定义了光软化区域，引导了肠道隐窝的形成。光图案化的尺寸决定了隐窝结构的尺寸和曲率轮廓，通过实时跟踪 PCs 的定位，证明了对隐窝形态和上皮曲率的控制能够调节 PCs 的密度和定位。该研究为深入理解肠道类器官的发育机制提供了重要依据，有望推动肠道疾病研究、药物筛选以及组织工程等领域的发展，为开发更有效的诊断和治疗方法奠定基础。未来的研究可以进一步跟踪 ISCs 细胞群体及其与 PCs 的相互作用，以更深入地了解细胞定位对肠道动态的影响。