香草酸通过抑制 STIM1 介导的 NLRP3 炎性小体激活对脂多糖诱导的急性肺损伤的保护作用：为急性肺损伤治疗带来新希望

为解决急性肺损伤（ALI）治疗难题，复旦大学研究人员开展了香草酸（VA）对 LPS 诱导的 ALI 影响及机制研究。结果发现 VA 可抑制 NLRP3 炎性小体激活，减轻 ALI。这为 ALI 治疗提供了新方向，有望推动相关药物研发。

　　急性肺损伤（Acute Lung Injury，ALI）如同肺部的一场 “风暴”，严重威胁着人们的健康。它常由感染、创伤等多种因素引发，会导致肺部出现广泛的炎症反应和组织损伤，呼吸功能也会因此受损。在严重情况下，ALI 还会进一步发展成急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。目前，针对 ALI/ARDS 的靶向药物治疗一直没有取得突破性进展，患者的死亡率高达 30% - 40% 。巨噬细胞在 ALI 的炎症反应中起着关键作用，过度激活的巨噬细胞会释放大量促炎介质，引发细胞因子风暴，加重肺损伤。NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白 3（NLRP3）炎性小体是细胞内的一种异质复合物，它的过度激活与多种疾病相关，在 ALI 中，NLRP3 炎性小体激活会促使炎症细胞浸润和激活，加剧肺部炎症和损伤。香草酸（Vanillic Acid，VA）是一种存在于多种植物中的天然有机化合物，具有抗炎、抗氧化等特性，但它在 LPS 诱导的 ALI 中的作用和机制尚不明确。为了探索其中的奥秘，复旦大学的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Inflammation》上，为 ALI 的治疗带来了新的希望。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是 RNA 测序（RNA-seq），通过分析基因表达变化，探究 VA 处理后的基因富集情况；其次是蛋白质免疫印迹法（Western blotting），用于检测细胞和组织中相关蛋白的表达水平；还有酶联免疫吸附试验（ELISA），用来测定细胞培养上清液和支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞因子的浓度；另外，还使用了实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative PCR），对基因表达水平进行定量分析。

研究结果如下：

• 香草酸减轻 LPS 诱导的巨噬细胞炎症反应并改善小鼠 ALI：通过细胞计数试剂盒 - 8（CCK-8）实验发现，浓度高达 100 μM/L 的 VA 对 J774A.1 细胞活力没有影响。实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）显示，VA 可降低 LPS 刺激的 IL¹β 和 IL-6 mRNA 表达。在体内实验中，建立 LPS 诱导的小鼠急性肺损伤模型，发现 VA 处理组小鼠症状较轻，BALF 中蛋白质含量、湿干肺重量比降低，肺组织病理变化改善，IL¹β 和 IL-18 水平下降。
• VA 处理后差异表达基因（DEGs）富集于 NLRP3 和 Ca²⁺信号通路：对 PMA 诱导的 THP1 细胞进行 RNA-seq 分析，发现 LPS + VA 组与 LPS 组相比，有大量上调和下调基因。Reactome 富集分析表明，Ca²⁺和 NLRP3 信号通路排名靠前，GO 分析显示 NLRP3 炎性小体复合物组装和自噬体组装的正向调节相关基因富集，KEGG 通路富集分析表明 NOD 样受体信号通路基因富集，DO 分析表明 DEGs 富集于多种炎症性疾病和肺部疾病。
• 香草酸在体内外均能抑制 NLRP3 炎性小体激活：ELISA 实验表明，VA 有效抑制 LPS 和尼日利亚菌素刺激的 J774A.1 细胞中 IL¹β 和 IL-18 的释放。免疫印迹分析显示，VA 使 J774A.1 细胞中成熟 IL¹β（p17）和活性半胱天冬酶 - 1（p20）的释放呈剂量依赖性减少，且不影响 ASC、NLRP3、前体半胱天冬酶 - 1 和前体 IL¹β 水平。在小鼠体内，VA 降低了肺组织中 IL⁶、IL¹β 和 IL-18 mRNA 表达，抑制了炎性小体的形成。
• 香草酸阻止巨噬细胞中 NLRP3 炎性小体激活引起的细胞焦亡和 ASC 斑点形成：Western blot 分析表明，VA 显著抑制尼日利亚菌素刺激的 LPS 预处理的 J774A.1 细胞中 GSDMD 的切割激活。光学显微镜下观察到，VA 处理的细胞细胞膜肿胀发生率呈剂量依赖性降低，PI 染色显示细胞焦亡减少。免疫荧光实验发现，VA 显著减少尼日利亚菌素诱导的 ASC 斑点形成。
• 香草酸通过溶酶体降解途径下调 STIM1 表达抑制内质网应激：免疫印迹分析显示，VA 降低 LPS 刺激诱导的 p-eIF2、ATF4 和 CHOP 蛋白的上调。Fluo-4 AM 钙离子荧光探针检测发现，VA 降低 LPS 刺激引起的细胞内钙离子水平升高。研究还发现，LPS 刺激显著增加 STIM1 蛋白表达，VA 处理可缓解这一现象，且该过程与溶酶体降解途径有关，VA 促进自噬体与溶酶体融合，减少 STIM1 蛋白水平。
• 敲低 STIM1 对炎性小体激活的影响与香草酸相似：在 THP-1 细胞中沉默 STIM1 表达，发现 STIM1 敲低抑制了 LPS 诱导的 ATF4 上调，但显著增加 CHOP 水平。免疫印迹分析表明，STIM1 下调减少了尼日利亚菌素诱导的成熟 IL¹β、活性半胱天冬酶 - 1 的分泌以及 GSDMD 的切割，且 VA 对这些蛋白的抑制作用在 STIM1 siRNA 处理后消失。
• 香草酸通过 STIM1 信号通路抑制 ALI 小鼠肺组织内质网应激：免疫印迹分析显示，LPS 滴注后小鼠肺组织中 STIM1 表达增加，VA 处理可降低其表达。RT-PCR 结果证实了 VA 对 LPS 诱导的小鼠肺组织中 STIM1 mRNA 上调的抑制作用。免疫荧光结果表明，VA 降低了气管内 LPS 滴注小鼠肺组织中 STIM1 和 ATF4 水平。

研究结论和讨论部分指出，NLRP3 炎性小体在炎症反应调节中起关键作用，VA 具有显著的抗炎作用，其机制与抑制 NLRP3 炎性小体过度激活有关，这与 STIM 介导的钙信号通路相关。内质网应激对 NLRP3 炎性小体的激活和调节有重要影响，VA 可抑制 LPS 刺激引起的内质网应激。STIM1 作为细胞内 Ca²⁺传感器，VA 通过促进其自噬降解抑制 NLRP3 炎性小体激活。ALI 是一种严重的炎症性肺部疾病，抗炎治疗对其有益，VA 有望成为治疗 ALI 的药物或膳食补充剂。不过，该研究也存在一定局限性，如主要使用 J774A.1 细胞系进行机制探索，未来需用骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）或原代细胞进一步验证；研究未设置专门的药物对照组，后续应加以完善。总体而言，该研究为 ALI 的治疗提供了新的方向和理论依据，为相关药物研发奠定了基础。