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为解决骨质疏松治疗难题，河北大学研究人员开展 ACT001 对骨质疏松作用的研究。结果发现 ACT001 可抑制 RANKL 诱导的破骨细胞分化，通过抑制 NF-κB/NLRP3 通路减轻 OVX 诱导的骨丢失，为骨质疏松治疗提供新方向。
骨质疏松，这个被称为 “21 世纪无声杀手” 的疾病，正悄然威胁着全球无数人的健康。随着人口老龄化加剧，越来越多的人被骨质疏松困扰。据统计，全球超过 2 亿人患有骨质疏松，50% 以上的绝经后女性饱受骨质疏松相关骨折的折磨。目前的治疗药物虽有一定效果，但长期使用存在高钙血症、下颌坏死、非典型股骨骨折等副作用，这使得开发更有效的抗骨质疏松治疗策略迫在眉睫。
雌激素缺乏是骨质疏松的主要病因，它会导致核因子 κB 受体活化因子配体（RANKL）激活增加，骨保护素（OPG）生成减少，打破骨重塑平衡，使破骨细胞活性增强。破骨细胞在骨吸收过程中扮演着关键角色，其分化受多种因素影响，抑制 RANKL/RANK 及其下游信号通路成为对抗骨质疏松的关键。此外，慢性炎症也与骨质疏松密切相关，雌激素缺乏引发的慢性炎症会激活 NOD 样受体家族含 pyrin 结构域 3（NLRP3）炎性小体，损害骨形成并促进骨吸收。
在这样的背景下，河北大学的研究人员开展了关于 ACT001 对骨质疏松作用的研究。ACT001 是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的孤儿药，具有多种生物活性，但其对骨质疏松的预防作用尚不明确。此次研究意义重大，若能证实 ACT001 对骨质疏松的治疗效果，将为广大患者带来新的希望，该研究成果发表在《Molecular Medicine》杂志上。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：细胞实验，利用 RAW264.7 细胞、骨髓来源的巨噬细胞（BMMs）和 MC3T3-E1 细胞进行相关实验；动物实验，建立卵巢切除（OVX）诱导的骨质疏松小鼠模型；分子生物学技术，如定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测基因表达、蛋白质免疫印迹（Western blot）分析蛋白表达、酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清骨代谢标志物等。
研究结果如下：
- ACT001 抑制 RANKL 诱导的破骨细胞分化：通过细胞活力实验（CCK-8 法）发现，ACT001 在最高浓度 10 μM 时，48 h 内对 RAW264.7 细胞和 BMMs 无明显毒性。用不同浓度的 ACT001 处理经 RANKL 诱导的 RAW264.7 细胞和 BMMs，进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，结果显示 ACT001 能剂量依赖性地抑制破骨细胞生成，且在破骨细胞生成早期抑制作用更明显。
- ACT001 抑制 RANKL 诱导的 F - 肌动蛋白（F-actin）环形成和破骨细胞吸收功能：对 RAW264.7 细胞进行 F-actin 和 4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚（DAPI）共染色，发现随着 ACT001 浓度增加，RANKL 诱导的 F-actin 环数量和大小均显著减少。通过骨吸收坑实验表明，ACT001 能显著降低破骨细胞的吸收活性，减少骨吸收坑面积。
- ACT001 下调破骨细胞相关基因和蛋白的表达：qRT-PCR 检测发现，ACT001 能剂量依赖性地下调 RAW264.7 细胞和 BMMs 中破骨细胞相关基因，如活化 T 细胞核因子 1（Nfatc1）、TRAP、组织蛋白酶 K（Ctsk）、树突状细胞特异性跨膜蛋白（Dc-stamp）的 mRNA 表达。Western blot 和免疫荧光实验进一步证实，ACT001 能抑制 Nfatc1 和 Ctsk 的蛋白表达。
- ACT001 主要抑制 RANKL 诱导的 NF-κB 信号通路激活：研究相关蛋白发现，ACT001 能抑制 RANKL 诱导的 p65 磷酸化，对 c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38）和细胞外调节蛋白激酶（ERK）的磷酸化影响较小。使用 MD2 抑制剂 MD2-IN-1 预处理细胞后发现，ACT001 的抑制作用可能依赖于 MD2，表明 ACT001 主要抑制 NF-κB 通路。
- ACT001 减弱 RANKL 诱导的 RAW264.7 细胞中 NLRP3 炎性小体激活：Western blot 检测发现，ACT001 能显著抑制 RANKL 诱导的 NLRP3、半胱天冬酶 - 1（Caspase-1）、gasdermin D（GSDMD）、白细胞介素 1β（IL-1β）和 IL-18 的表达。与 NLRP3 炎性小体特异性强效抑制剂 MCC950 对比，ACT001 对破骨细胞分化的抑制作用与 MCC950 相当甚至更强。
- ACT001 在体外不促进成骨细胞分化和矿化：CCK-8 实验表明 ACT001 对 MC3T3-E1 细胞活力无影响。对 MC3T3-E1 细胞进行碱性磷酸酶（ALP）和茜素红 S（ARS）染色，以及检测成骨相关基因 mRNA 表达，结果显示 ACT001 对成骨细胞分化和矿化无明显促进作用。
- ACT001 预防 OVX 小鼠模型的骨丢失：建立 OVX 诱导的骨质疏松小鼠模型，给予不同处理后，进行 Micro-CT 扫描、组织学和免疫组化分析、血清 ELISA 检测。结果表明，ACT001 能减少骨小梁丢失，增加骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.n）和骨小梁厚度（Tb.Th），降低骨小梁模式因子（Tb.pf）；下调血清骨转换指标，减少破骨细胞数量，降低 NLRP3 和 IL-1β 表达。同时，对主要器官进行组织病理学检查发现，ACT001 安全性良好。
研究结论和讨论部分指出，ACT001 可通过抑制 NF-κB/NLRP3 通路和 NLRP3 炎性小体引发的细胞焦亡级联反应，抑制 Nfatc1 的转录激活，从而在体外抑制 RANKL 诱导的破骨细胞生成和分化，在体内减轻 OVX 诱导的骨质疏松。与 MCC950 相比，ACT001 可能具有更广阔的应用前景。此外，ACT001 及其活性代谢物均显示出潜在的抗骨质疏松活性，且 ACT001 具有稳定性好、溶解性好、毒性低、副作用小等优点，已在多项临床试验中得到验证，未来有望用于卵巢癌术后治疗并预防雌激素缺乏诱导的骨质疏松。但该研究仅在 100 mg/kg 剂量下验证了 ACT001 对 OVX 小鼠模型的抗骨质疏松效果，更高剂量或其他类型骨质疏松动物模型的治疗效果仍有待进一步研究。
