MSFragger-DDA+：基于全隔离窗搜索提升肽段鉴定灵敏度的创新算法

在基于液相色谱 - 质谱（LC-MS）的蛋白质组学研究中，传统数据库搜索工具在处理数据依赖性采集（DDA）质谱数据时，难以准确鉴定共碎裂肽段。研究人员开展了关于 MSFragger-DDA+算法的研究，结果显示该算法能提高肽段鉴定灵敏度，为蛋白质组学数据分析提供了更高效准确的方案。

　　在生命科学研究的广袤领域中，蛋白质组学犹如一座神秘的宝藏矿山，蕴含着无数关于生命奥秘的线索。液相色谱 - 质谱（LC-MS）技术作为探索这座矿山的有力工具，尤其是在自下而上的蛋白质组学研究方法中，发挥着至关重要的作用。它先将蛋白质消化成肽段，再对这些肽段进行分离和分析，从而帮助科研人员了解蛋白质的各种信息，包括翻译后修饰、蛋白质 - 蛋白质相互作用等，这些信息对于研究癌症等疾病、SARS-CoV-2 病毒感染机制等有着重要意义。

然而，目前在利用数据依赖性采集（DDA）质谱数据进行肽段鉴定时，却遭遇了重重困难。传统的数据库搜索工具就像戴着有色眼镜的寻宝者，往往只关注单个肽段，忽略了频繁出现的肽段共碎裂现象，导致大量共碎裂肽段在鉴定过程中被遗漏，这就好比在宝藏矿山中，许多珍贵的宝石被视而不见。此外，对于复杂样本，即使使用较窄的隔离窗，仍有相似质量的共洗脱肽段发生共碎裂，产生嵌合的 MS2 光谱，进一步增加了肽段鉴定的难度。而且，现有的工具对于宽窗采集（WWA）DDA 数据的支持也非常有限，这使得科研人员在处理这类数据时常常束手无策。

为了突破这些困境，来自美国密歇根大学（University of Michigan）的研究人员 Fengchao Yu、Yamei Deng 和 Alexey I. Nesvizhskii 勇敢地踏上了探索之旅，开展了关于 MSFragger-DDA⁺算法的研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为蛋白质组学研究带来了新的曙光。

研究人员为开展这项研究，主要运用了以下关键技术方法：首先是数据库搜索技术，MSFragger-DDA⁺算法突破传统，对每个串联质谱在全隔离窗内进行全面搜索；其次是利用 FragPipe 计算平台，将 MSFragger-DDA⁺集成其中，实现从肽段鉴定到定量分析的完整流程；此外，还运用了如前体提取离子色谱（XIC）检测、共享片段去除和重新评分等技术，对搜索结果进行优化。

下面来看看具体的研究结果：

• MSFragger-DDA⁺算法概述：MSFragger-DDA⁺算法在数据库搜索时，与传统算法不同，它对每个 MS2 光谱在全隔离窗内搜索所有肽段，通过 hyperscore 衡量肽段与光谱的相似性。之后，进行前体 XIC 检测、共享片段去除和重新评分等操作。该算法优化了处理速度和内存使用，并且被集成到 FragPipe 计算套件中，方便后续分析。
• MSFragger-DDA⁺提高肽段鉴定灵敏度：研究人员使用两个 DDA 数据集进行评估，结果显示，MSFragger-DDA⁺在不同归一化碰撞能量（NCE）和酶消化、碎裂组合条件下，比传统 DDA 模式的 MSFragger 以及其他工具能鉴定出更多的肽段序列，平均多出 15% - 57%。
• MSFragger-DDA⁺具有良好的假发现率控制：通过构建诱捕数据库搜索评估假发现率（FDR），发现 MSFragger-DDA⁺不仅鉴定出的目标肽段序列和蛋白质数量最多，而且 FDR 与 MSFragger 相似，比其他工具更低。
• MSFragger-DDA⁺在 DDA-PASEF 数据分析中的应用：在分析 timsTOF DDA-PASEF 数据时，MSFragger-DDA⁺耦合 FragPipe 比传统 DDA 工作流程具有更高的灵敏度，能定量更多的蛋白质。虽然在匹配运行间（MBR）启用时差异缩小，但 DDA⁺工作流程仍能定量更多蛋白质。在定量质量方面，不同工作流程鉴定出的蛋白质变异系数（CV）存在差异，DDA⁺工作流程定量的蛋白质缺失值比例与传统工作流程相当。
• MSFragger-DDA⁺对宽窗采集数据的支持：利用多个 WWA 数据集研究发现，MSFragger-DDA⁺在处理这类数据时表现出色，与其他工具相比，能鉴定出更多的肽段或定量更多的蛋白质，且速度更快，例如在分析某数据集时，比 CHIMERYS 和 Proteome Discoverer 快至少 20 倍。
• MSFragger-DDA⁺在磷酸蛋白质组数据分析中的优势：在分析磷酸化富集数据时，MSFragger-DDA⁺比传统 DDA 模式的 MSFragger 能鉴定出更多的磷酸化位点（约多 5%）和磷酸化序列（约多 14%）。
• MSFragger-DDA⁺助力检测更多差异表达蛋白质和基因：通过分析 IDH 突变的胶质瘤患者数据集，发现 MSFragger-DDA⁺耦合 FragPipe 能鉴定出更多的蛋白质，减少缺失值，从而检测出更多的差异表达蛋白质和基因，在癌症蛋白质组学分析中具有重要意义。

研究结论和讨论部分指出，MSFragger-DDA⁺算法打破了传统 DDA 肽段鉴定策略的局限，通过全隔离窗搜索和独特的重新评分机制，能够更敏锐地识别低丰度、共碎裂的肽段。在单细胞蛋白质组学研究中，它为分析低输入样本提供了有力支持，极大地拓展了蛋白质组覆盖深度，而且其快速的处理速度也解决了单细胞研究数据处理的瓶颈问题。同时，MSFragger-DDA⁺是 MSFragger 工具家族的重要一员，它统一了不同数据采集模式下的肽段鉴定流程，为蛋白质组学研究提供了更通用、更高效的解决方案。不过，该算法也存在一些局限性，比如在处理某些特定场景（如基于等压标记的定量工作流程）时可能效果不佳，且目前不支持开放或质量偏移搜索，限制了其在未知翻译后修饰鉴定和发现中的应用。但总体而言，MSFragger-DDA⁺算法的出现，为蛋白质组学研究开辟了新的道路，推动了生命科学和健康医学领域的发展，让我们在探索生命奥秘的征程中又迈出了坚实的一步。