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推荐阅读！本文运用单细胞 RNA 测序（snRNA-seq）和空间转录组学技术，剖析蜜蜂从哺育到觅食行为转变时脑细胞的表达模式。研究发现特定基因调控网络（GRN）协调脑细胞活动，为理解 GRN 驱动的大脑异质性及社会分工机制提供了重要依据。
研究背景
动物行为受神经系统调控，大脑中的基因转录状态也与行为变化密切相关。社会性昆虫蜜蜂具有高度发达的社会结构和丰富的行为模式，工蜂会从哺育任务转变为觅食任务，这种行为转变与大脑神经基因组状态相关，但此前缺乏对细胞异质性和细胞群体表达差异的深入研究。本研究旨在构建蜜蜂自然行为成熟过程中大脑的高分辨率分子景观，探究基因调控网络（GRN）与行为状态的关系。
研究方法
- 样本采集：在 2020 年 8 月于中国农业大学实验蜂场采集蜜蜂样本。通过设立单群蜂群控制哺育蜂年龄，采集 10 日龄哺育蜂和 21 - 23 日龄觅食蜂的大脑，迅速解剖后冻存于 - 80°C。
- 实验技术
- 单细胞测序（snRNA-seq）：将 4 个冷冻大脑组织在含多种成分的匀浆缓冲液中匀浆，经多次离心、过滤和重悬制备单细胞核悬液，用 DNBelab C4 系统构建文库并测序。
- 空间转录组学（Stereo-seq）：采集新鲜大脑组织，去除部分腺体后冷冻包埋、切片，将切片置于 Stereo-seq 芯片上进行一系列处理，包括固定、染色、RNA 释放、捕获、反转录等，最终进行测序。
- 数据分析方法
- snRNA-seq 数据分析：对原始测序数据进行过滤、比对、注释等处理，用 Seurat 软件进行细胞质量控制、整合和聚类分析，通过查找标记基因注释细胞类型，计算物种间细胞簇转录相似性，进行差异表达基因（DEG）分析。
- Stereo-seq 数据分析：对 Stereo-seq 原始数据进行处理和聚类分析，用 Tangram 将 snRNA 数据映射到 Stereo-seq 数据上，进行 SCENIC 分析构建基因调控网络，通过荧光原位杂交（FISH）验证基因表达。
研究结果
- 蜜蜂脑细胞类型鉴定：从 136 只哺育蜂和 80 只觅食蜂的大脑中分离出 121,247 个高质量细胞，鉴定出包括肯扬细胞（KCs）、神经胶质细胞（Glia）、视叶细胞（OLCs）等多种细胞类型。通过标记基因和跨物种分析验证了注释结果，不同细胞类型在基因本体（GO）分析中显示出不同的生物学功能富集。
- 构建蜜蜂大脑细胞类型的空间景观：应用 Stereo-seq 技术对蜜蜂大脑切片进行分析，获得了具有细胞分辨率的空间转录组图谱。通过聚类分析确定了大脑不同区域的功能区域，验证了 KCs、OLCs 和 Glia 在大脑中的定位，为后续研究细胞活动的空间异质性提供了基础。
- 细胞亚型的空间异质性和进化
- KCs 亚型分析：重新聚类 KCs 转录组数据，鉴定出 5 个不同的 KCs 群体，包括 lKCs、mKCs、sKCs 和两种 Class-II KCs 亚型。不同亚型具有不同的标记基因和功能，与其他昆虫的 KCs 聚类分析显示，蜜蜂 KCs 与蚂蚁的相似性较高。
- OLCs 亚型分析：重新聚类 OLCs 数据，比较蜜蜂与蚂蚁、果蝇的 OLCs 聚类结果，发现蜜蜂 OLCs 与蚂蚁和果蝇的部分聚类相似。其中，OLC4 与果蝇的层状单极细胞相似，可能代表蜜蜂第一视神经节中的 L - 纤维，且在蜜蜂视叶的特定区域富集。
- 与行为成熟相关的细胞类型特异性基因表达变化：鉴定出觅食蜂和哺育蜂中分别有 1265 和 1016 个上调基因，部分基因在不同细胞类型中特异性表达。与之前的批量分析相比，发现批量分析检测到的基因表达变化可归因于特定细胞类型，单细胞分辨率有助于发现细胞对行为状态的异质性响应。
- 基因调控网络的空间异质性：构建了蜜蜂的 SCENIC 数据库，鉴定出 184 个调控子，发现不同细胞类型具有特定的调控子活动模式。比较哺育蜂和觅食蜂的调控子活性，发现 stripe 和 Hr38 调控子在觅食蜂的 KCs 中富集，尤其是 sKCs。通过 FISH 验证了 stripe 及其靶基因在觅食蜂大脑中的高表达，表明 GRN 的空间异质性可能协调蜜蜂的行为成熟。
研究讨论
- 蘑菇体（MBs）与社会性行为发展：蜜蜂的 MBs 结构比其他昆虫更复杂，KCs 比例较大，与蚂蚁的 KCs 在进化上具有保守性。不同类型的 KCs 具有不同的转录组和功能特征，mKCs 可能在行为成熟过程中参与感觉信息处理，这表明 MBs 的发育与蜜蜂的社会性行为发展相关。
- 视叶（OLs）与信息处理：OLs 是蜜蜂重要的感觉器官，OLC4 可能代表蜜蜂 OLs 中的 L - 纤维，与果蝇的单极细胞具有相似的基因表达模式，且与 GABA 介导的神经元网络相关。这表明大脑中区域特异性的 GABA 介导的神经元网络可能参与蜜蜂在觅食过程中的复杂信息处理。
- 基因表达变化与行为关系：蜜蜂行为转变与大脑基因表达谱的变化密切相关，这种变化具有细胞类型特异性。GRN 协调基因表达变化，stripe 在觅食蜂的 MBs 中上调，在 sKCs 中具有较高的调控子活性，可能参与空间学习和导航行为，同时其在不同细胞类型中的活性存在差异。
- 研究的局限性与展望：本研究存在一些局限性，如空间转录组学分析无法清晰界定某些大脑区域，snRNA-seq 和空间转录组学的细胞采样存在差异。未来可通过构建全脑 3D 表达图谱、整合神经元网络和 GRN 等方法，进一步深入研究蜜蜂行为的分子机制以及从独居到社会生活的进化过程。
