天然产物氯托菌素：抗菌机制复杂、多靶点作用，有望成为抗耐药菌新星

本文聚焦氯托菌素（Chlorotonils），其作为天然产物，对多重耐药菌和疟原虫有活性。研究揭示其通过干扰离子稳态使细胞膜去极化，还作用于肽聚糖合成蛋白 YbjG 和蛋氨酸氨肽酶 MetAP，且优化后的先导结构在小鼠模型中安全，为抗生素开发带来新希望。

　　

研究背景

抗菌耐药（AMR）严重威胁人类健康，2019 年全球因 AMR 导致 127 万人死亡，预计到 2050 年每年死亡人数将增至 1000 万，经济损失高达 4 万亿美元。目前市场上所有抗生素都面临细菌耐药问题，新抗生素研发困难，近十年仅有 19 种小分子抗菌药获批，且无新类别。世界卫生组织呼吁开发针对重点病原体的新治疗方案。天然产物是新抗菌药物的重要来源，氯托菌素是从粘细菌中分离出的大环抗生素，对耐万古霉素肠球菌（VRE）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和疟原虫有良好活性，此前已报道其半合成方法及在小鼠感染模型中的活性和安全性，但作用机制未知。

研究结果

1. 氯托菌素作用迅速且不导致严重膜屏障破坏：DHG 对金黄色葡萄球菌 ATCC29213 的最小抑菌浓度（MIC）为 31.25 ng/mL，在远低于 MIC 浓度下就有抑制活性，低至 2 ng/mL 时显著延迟最大生长速率，0.5 ng/mL 时仍有影响。添加 DHG 到金黄色葡萄球菌早期指数生长期细胞，无裂解作用但立即抑制生长，而 10 μM 蜂毒肽 1 小时内可完全裂解细胞。DHG 对结核分枝杆菌和外膜受损的大肠杆菌 ΔtolC 也有活性。DHG 作用迅速，超 MIC 处理几分钟后，菌落形成单位（CFU）显著减少，表现出杀菌作用；亚 MIC 处理时，细胞先出现 CFU 下降，约 3 小时后恢复生长，但并非产生自发耐药。电子显微镜显示，10 倍 MIC 的 DHG 处理 1 小时后，金黄色葡萄球菌细胞完整，膜看似完整但有膜内陷；SYTO9 / 碘化丙啶（PI）染色表明细胞膜完整无大孔形成；用 FM5-95 染色枯草芽孢杆菌 168，处理 4 小时后部分细胞增大，暗示细胞壁受影响。
2. 去卤菌素通过结合磷酸酶 YbjG 影响肽聚糖合成：DHG 处理细胞的异常形态表明细胞壁可能减弱，检测发现 B. subtilis 中 liaI 启动子在 1 倍 MIC 的 DHG 处理 3 小时后轻度诱导，指示细胞 wall 合成中十一碳烯醇循环受干扰；金黄色葡萄球菌中 UDP-MurNAc 五肽轻度积累，5 倍 MIC 处理时相比未处理细胞增加高达 300%。进一步研究证实 DHG 可剂量依赖性抑制 YbjG（IC₅₀ = 32.5 ng/mL；0.079 μM），而对 MraY、MurG 和 PBP2 催化的反应无影响。微尺度热泳（MST）证实 DHG 与 YbjG 直接结合（K_D = 5.75 ± 0.57 μM），但 YbjG 抑制不能完全解释氯托菌素的快速杀菌动力学。
3. 氯托菌素的活性主要由膜去极化介导：使用能发射红色荧光的 Nernstian 染料 DiOC₂(3) 检测发现，低至 2 - 4 ng/mL 的 DHG 就能引起金黄色葡萄球菌细胞膜电位（V_m）变化，去极化程度随 DHG 浓度增加而更明显，4 - 8 倍 MIC 时达到峰值，相比 DMSO 对照约为 40% V_m水平，但不如 5 μM CCCP 诱导的迅速和广泛。利用枯草芽孢杆菌 1981 报告菌株观察到，DHG 处理 2 分钟内 GFP-MinD 就发生去定位，进一步验证膜去极化是 DHG 的主要细胞效应。通过 K⁺选择性电极测量发现，添加 DHG 后细胞外 [K⁺] 立即增加，约 2 分钟（10 μg/mL/24 μM）或 8 分钟（1 μg/mL/2.4 μM）达到最大浓度；ICP-MS 证实 DHG 处理 30 分钟后，细胞内 [Na⁺] 增加 10 倍，[K⁺] 几乎降至检测限以下。盐离子对 DHG 抗菌活性影响实验表明，400 mM K⁺几乎完全消除 DHG 活性，而高 [Na⁺] 增强其活性，说明 K⁺外流是氯托菌素抗菌活性的主要驱动因素。在添加 400 mM K⁺的实验中，金黄色葡萄球菌在 DHG 处理 1.5 小时后添加 K⁺能快速恢复生长，8 小时处理后则需 10 小时以上恢复，且恢复生长的细胞出现小菌落变体，时间 - 杀菌动力学显示细胞在处理后有快速 CFU 减少和恢复生长的过程。
4. 蛋白质组学分析揭示对钾稳态和次要靶点 MetAP 的影响：对氯托菌素处理的金黄色葡萄球菌进行蛋白质组分析，包括全蛋白质组分析和热蛋白质组分析（TPP）。全蛋白质组分析发现，与未处理细胞相比，0.2 倍 MIC 的 DHG 处理使 16 种蛋白质上调，26 种蛋白质下调。上调蛋白质中，主要钾摄取系统 KdpABC 和一些分泌性细菌溶血素显著富集；下调蛋白质中，BetA、GbsA 和 CudT 参与原核渗透保护剂甘氨酸甜菜碱（GB）的生物合成，但未发现显著功能富集。TPP 发现 8 种蛋白质稳定，8 种蛋白质不稳定。不稳定蛋白质包括 3 种核糖体蛋白和 D-Ala-D-Ala 连接酶；最稳定的蛋白质是 KefA，一种小电导机械敏感离子通道蛋白，此外糖基转移酶 BsaH 也显著稳定。MetAP 是唯一稳定且对生长必需的蛋白质，体外活性测定表明氯托菌素可剂量依赖性抑制 SaMetAP，且其抑制作用不是因辅因子耗尽，而是直接抑制蛋白质，但 MetAP 抑制不能解释氯托菌素的主要活性。
5. 对氯托菌素的耐药由 FarR/FarE 过表达介导：通过长期暴露和适应（LEA）方法在金黄色葡萄球菌 ATCC29213 中诱导耐药，经过多轮传代后获得耐药菌株，其 MIC 显著升高。测序分析发现所有突变体（n = 24）都携带 farR 突变，编码 FarE 脂肪酸和脂质外排泵的负调节因子，部分突变体还携带其他基因突变，但与耐药表型无直接相关性。Ch^R金黄色葡萄球菌对罗丹明（ROM）也耐药，提示可能存在相似的脂质介导耐药机制。qPCR 和全蛋白质组分析证实，Ch^R金黄色葡萄球菌中 farR 和 farE 表达上调，高耐药突变体中 BetA/GbsA 丰度增加，KdpC 减少。
6. DHG 与膜脂质和脂肪酸结合，但交叉反应在小鼠中未诱导不良影响：添加脂肪酸和脂质到金黄色葡萄球菌药敏试验中，发现饱和脂肪酸 / 脂质可使 DHG 活性降低多达 16 倍，不饱和脂肪酸影响较小，脂质头部基团影响不大。由于溶解性和非特异性结合问题，等温滴定量热法（ITC）和表面等离子共振（SPR）不适合研究 DHG 与脂肪酸和脂质的相互作用，采用原生脂质质谱证实了 DHG 与所有测试膜脂质直接相互作用，检测到相应质量信号和 MS/MS 片段光谱，还发现 DHG 多聚体。测量人工 POPG 膜的比膜电容，发现 DHG 存在时比膜电容显著增加，首次证实其蛋白质非依赖的膜效应。对不同细胞系进行筛选，发现 DHG 对 HEK293、HCT116 和 CHO-K1 细胞的 IC₅₀值在 5.4 - 9.8 μM，高于体内 c_max，与金黄色葡萄球菌相比有较高选择性指数；HepG2 细胞不敏感。用非生理浓度 DHG 处理真核细胞，发现部分细胞有钾泄漏但无裂解行为；处理红细胞发现 10 μg/mL DHG 使细胞外 [K⁺] 轻度增加。在小鼠实验中，给予有效剂量的 DHG 连续四天，未观察到动物异常行为，血液 [K⁺] 无显著变化，表明 DHG 在小鼠中耐受性良好。

研究讨论

1. 复杂的抗菌机制：本研究首次对氯托菌素的作用机制进行详细研究，证实其为膜活性抗生素，通过诱导单价阳离子运输失调导致膜去极化，可能还通过 YbjG 和 MetAP 分别作用于肽聚糖和蛋白质生物合成，脂质介导的蛋白质非依赖膜活性可能是其对革兰氏阳性菌抗菌活性的主要驱动因素。
2. 耐药机制与临床相关性：氯托菌素耐药与 FarR/FarE 脂肪酸和脂质外排系统突变有关，Ch^R突变体对 ROM 交叉耐药，提示相似的脂质介导耐药机制。补充脂质和脂肪酸可降低 DHG 体外活性，但目前尚未在临床分离株中观察到脂质外排介导的耐药，且 FarE 过表达导致的耐药水平有限，其体内相关性有待进一步研究。
3. 膜相互作用模型：由于氯托菌素的物理化学性质限制，难以用传统方法研究其与脂质的相互作用。原生脂质质谱证实其与脂质结合，推测其可能通过类似桶板模型整合到膜中，与饱和酰基链疏水相互作用，亲水性内酯朝向极性头部基团，但不确定是否形成实际通道。
4. 对真核细胞的影响与安全性：虽然氯托菌素与真核脂质结合，在体外对部分细胞系有一定毒性，但 IC₅₀值高于对细菌的活性和小鼠体内最大血清浓度。在小鼠实验中，有效剂量的 DHG 未引起血液钾浓度变化，耐受性良好，但仍需进一步研究其体内耐受性和对脂质 / 脂肪酸的选择性。
5. 研究局限性：氯托菌素可能通过抑制 YbjG 影响细胞壁生物合成，但未检测 MurJ 抑制对五肽积累的影响；本研究未完全评估该化合物类别的选择性和特异性，未来需进一步研究以确定 DHG 的安全性。

综上所述，氯托菌素具有独特的抗菌机制和多靶点作用，优化后的先导结构 DHG 在小鼠模型中安全，有望成为开发抗耐药菌抗生素的有前景分子。