斑马鱼幼体烧伤创面感染模型：揭秘对抗多种致病真菌的免疫防线

这篇研究利用斑马鱼幼体烧伤创面感染模型，研究宿主与真菌的相互作用。发现烟曲霉（Aspergillus fumigatus）和白色念珠菌（Candida albicans）可定植烧伤组织，巨噬细胞和中性粒细胞在抗真菌免疫中起协同冗余作用，为研究烧伤创面真菌感染提供新视角。

　　

引言

全球每年约有 1100 万烧伤病例，近 20 万人死亡。烧伤创面感染（BWIs）是烧伤患者死亡的主要原因，其中真菌感染呈上升趋势，严重烧伤患者中高达 44% 会发生继发真菌感染，一旦播散，死亡率可高达 76%。目前对真菌如何定植烧伤组织及宿主免疫反应知之甚少，现有的动物模型存在局限性，而斑马鱼幼体因具有光学透明、免疫反应保守等优势，有望成为研究烧伤创面真菌感染的理想模型。

结果

1. 致病真菌定植免疫健全的斑马鱼幼体烧伤创面：通过对 3 天受精后（dpf）的斑马鱼幼体进行烧伤处理，并分别接种荧光标记的烟曲霉孢子或白色念珠菌酵母细胞。研究发现，烟曲霉和白色念珠菌都能成功定植于烧伤创面。烟曲霉在烧伤后 24 小时（hpb）达到真菌负荷峰值，随后被清除；白色念珠菌则持续时间更长，72 hpb 时真菌负荷仍较高，且二者在感染过程中都发生了形态转变 。
2. 真菌定植增加烧伤部位免疫细胞募集：感染荧光标记巨噬细胞（mpeg-GFP）和中性粒细胞（lyz-BFP）的斑马鱼幼体后发现，在烟曲霉和白色念珠菌感染时，24 hpb 时巨噬细胞和中性粒细胞都被募集到烧伤创面，之后随时间减少。白色念珠菌感染时，24 hpb 时巨噬细胞和中性粒细胞数量均增加；烟曲霉感染时，仅中性粒细胞数量增加。同时，巨噬细胞与真菌的相互作用更为频繁，可能在控制真菌感染中起更直接的作用。
3. 巨噬细胞耗竭导致烧伤创面真菌负荷增加：为探究巨噬细胞在烧伤创面感染（BWI）中的作用，向表达荧光标记巨噬细胞的 2 dpf 斑马鱼幼体尾静脉注射氯膦酸盐脂质体，以耗竭巨噬细胞。结果显示，感染烟曲霉和白色念珠菌的幼体，在巨噬细胞耗竭后，真菌负荷均显著增加，尤其在感染早期（24 hpb 内），表明巨噬细胞在控制真菌负荷方面起重要作用。
4. 中性粒细胞缺乏导致烧伤组织内菌丝生长增加：利用表达显性负性 Rac2（RacD57N）蛋白的斑马鱼（mpx:rac2D57N），其中性粒细胞无法迁移到感染部位。研究发现，感染烟曲霉和白色念珠菌的 mpx:rac2D57N 斑马鱼，均出现真菌负荷增加、菌丝生长和侵袭增强的现象，说明中性粒细胞在控制真菌菌丝生长和侵袭中起关键作用。
5. 巨噬细胞和中性粒细胞功能受损增加侵袭性真菌感染：使用在白细胞中表达显性负性 Rac2D57N 的斑马鱼（coro1a:GFP-rac2D57N），其巨噬细胞和中性粒细胞均存在迁移缺陷。感染烟曲霉时，虽真菌负荷和发芽率未明显增加，但侵袭性菌丝生长增加；感染白色念珠菌时，真菌负荷显著增加，菌丝大量生长且侵袭严重，表明巨噬细胞和中性粒细胞在控制白色念珠菌感染中至关重要。
6. 增加 β(1,3)- 葡聚糖暴露减弱白色念珠菌在斑马鱼烧伤创面的定植：白色念珠菌突变体 STE11/P_tet-offSTE11^ΔN467和 fgr41Δ/Δ，其细胞壁 β(1,3)- 葡聚糖暴露增加。感染这些突变体的斑马鱼，烧伤创面真菌负荷显著低于感染野生型白色念珠菌的斑马鱼，说明掩盖 β(1,3)- 葡聚糖是白色念珠菌成功定植烧伤组织的重要机制。

讨论

斑马鱼作为研究烧伤创面真菌感染的模型具有独特优势，其幼体皮肤结构和伤口愈合方式与人类有相似之处，且光学透明便于成像研究。研究发现，烟曲霉和白色念珠菌对宿主免疫反应的影响不同，可能与它们的代谢特性和结构差异有关。巨噬细胞和中性粒细胞在感染不同阶段发挥不同作用，且二者功能存在协同和冗余。同时，该研究区分了定植和感染的概念，中性粒细胞在防止真菌侵袭中起关键作用。此外，通过研究白色念珠菌细胞壁突变体，发现掩盖 β(1,3)- 葡聚糖对组织定植至关重要，但细胞壁其他成分的变化也可能影响感染结果，需进一步研究。

材料和方法

1. 斑马鱼饲养和维护：成年斑马鱼在 14/10 h 光暗循环下饲养，实验胚胎在 28.5°C 培养。
2. 真菌菌株生长和条件：烟曲霉和白色念珠菌菌株保存于 - 80°C 甘油冻存管。烟曲霉实验前需在葡萄糖基本培养基（GMM）平板上活化，白色念珠菌则在 YPD 琼脂平板上活化，然后制备用于感染的菌液。
3. 热损伤和感染：3 dpf 斑马鱼幼体麻醉后，用细尖烧灼笔烧伤尾鳍，随后接种真菌溶液或作为对照，感染后继续培养用于后续分析。
4. 氯膦酸盐脂质体注射：向 2 dpf 表达荧光巨噬细胞的转基因幼体尾静脉注射氯膦酸盐或 PBS 脂质体，3 dpf 时进行感染实验。
5. 通过菌落形成单位计数真菌负荷：在不同时间点收集感染的斑马鱼幼体，匀浆后在相应培养基平板上培养，计数菌落形成单位（CFUs）。
6. 活体成像采集：将麻醉后的斑马鱼幼体固定在玻璃底培养皿中，用旋转盘共聚焦显微镜采集尾鳍图像。
7. 成像分析和处理：使用 FIJI ImageJ 软件处理和分析图像，测量真菌负荷、白细胞募集等指标。
8. β(1,3)- 葡聚糖染色：对真菌 β(1,3)- 葡聚糖进行染色，使用特定的二抗，染色后用显微镜成像并分析。