揭秘肺炎链球菌 StkP 近膜结构域磷酸化：细胞分裂调控新机制

本文聚焦肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）中丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶 StkP 的近膜结构域（JMD）。研究发现 JMD 的磷酸化影响细胞分裂，为理解细菌丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶的调控功能提供了新视角，对探究细菌生理机制意义重大。

　　

引言

细菌拥有多样的细胞形态，其形成依赖于保守和物种特异性的蛋白质及机制，其中肽聚糖的组装是关键环节。在球菌和卵球菌中，肽聚糖仅在细胞中部合成，用于形成隔膜交叉壁和细胞伸长。肺炎链球菌作为研究细胞分裂和形态发生的重要模型，其肽聚糖组装由 FtsZ 协调，且在细胞分裂和伸长过程中存在两种不同模式的肽聚糖合成，这两种模式需精细调控。

丝氨酸 / 苏氨酸激酶 StkP 在肺炎链球菌形态发生调控中起关键作用，它能磷酸化多种参与细胞分裂和形态发生的蛋白质，还可通过直接的蛋白质 - 蛋白质相互作用影响其他细胞分裂蛋白的功能。StkP 属于 Hanks 型激酶超家族，包含胞外结构域、胞质催化结构域，二者通过长的近膜结构域（JMD）与跨膜螺旋相连。在真核膜激酶中，JMD 具有多种功能，但在 StkP 中其功能尚不清楚，本研究旨在探究 StkP 的 JMD 功能及其在肺炎链球菌细胞分裂和形态发生中的作用。

结果

1. JMD 对 StkP 激活并非必需：构建缺失 JMD 的菌株（stkP-ΔJMD），该菌株细胞生长无明显缺陷，但细胞形态异常，约 40% 的细胞呈链状，细胞长度显著缩短。分析其体内磷酸化模式发现，StkP 虽保留一定活性，能使 MacP 磷酸化，但对 MapZ、EloR 和 DivIVA 的磷酸化严重受损。构建 N 端 GFP 融合的gfp-stkP-ΔJMD菌株，证实底物磷酸化缺陷并非由 StkP 定位异常导致。此外，构建 JMD 串联重复菌株（stkP-JMD_2x），其磷酸化模式、生长和形态与野生型（WT）细胞无差异，表明 JMD 对 StkP 激活并非必需，其精确长度对 StkP 激活也不关键，JMD 可能有助于催化结构域与底物的定位和相互作用。
2. JMD 中 7 个苏氨酸残基的磷酸化影响肺炎链球菌细胞形态：先前研究报道了细菌丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶 JMD 中部分残基可被磷酸化，对肺炎链球菌进行磷酸化蛋白质组分析，确定了 StkP 的 JMD 中有 7 个苏氨酸（T293、T295、T303、T305、T314、T327 和 T330）可被磷酸化。构建两个突变株stkP-7TA（模拟永久去磷酸化）和stkP-7TE（模拟永久磷酸化），分析发现二者生长和活力与 WT 菌株无显著差异，磷酸化模式也无明显不同，但stkP-7TE突变株细胞明显更短更薄，而stkP-7TA细胞与 WT 细胞无差异，表明 JMD 去磷酸化不影响细胞分裂，而模拟永久磷酸化会影响肺炎链球菌细胞形态，但不影响细胞最终分离。
3. stkP-7TE突变株中 StkP 和 FtsZ 在分裂隔膜早期定位：为研究stkP-7TE突变株细胞形状缺陷的原因，构建 N 端 GFP 融合的gfp-stkP-7TA和gfp-stkP-7TE菌株，分析 StkP 在细胞周期中的动力学。结果显示，WT 细胞中 GFP-StkP 在细胞周期晚期才重新定位到细胞赤道（未来子细胞的分裂位点），gfp-stkP-7TA细胞中定位模式类似，而gfp-stkP-7TE突变株中 GFP-StkP-7TE 在细胞周期早期（阶段 3）就在未来分裂位点出现荧光信号。以 FtsZ 为追踪细胞分裂机器组装的指标，构建stkP-7TA, ftsZ-gfp和stkP-7TE, ftsZ-gfp菌株，分析 FtsZ 动力学发现，WT 细胞中 FtsZ-GFP 在细胞分裂早期和中期（阶段 1、2 和 3）定位在分裂隔膜，阶段 3 时重新定位到细胞赤道，stkP-7TA菌株中类似，而stkP-7TE菌株中 FtsZ-GFP 在阶段 2 就在细胞赤道出现荧光信号。这些结果表明 JMD 磷酸化显著影响细胞分裂机器在分裂隔膜定位的时间，stkP-7TE突变株细胞长度减少可能是由于分裂体的早期定位。
4. StkP 的磷酸模拟形式促进细胞收缩：鉴于 JMD 磷酸化减少细胞长度并促进分裂机器早期定位，推测stkP-7TE突变可能触发早期细胞收缩。在细胞收缩受阻导致细胞伸长的背景下（如stkp-K42M突变株，其催化赖氨酸 K42 突变，激酶活性丧失），引入stkP-7TA或stkP-7TE突变。结果显示，stkP-K42M-7TA细胞形态与stkP-K42M细胞相似，明显更长更宽，而stkP-K42M-7TE细胞形态接近 WT 细胞，且生长分析表明stkP-K42M-7TE突变株细胞生长改善。通过计算细胞收缩因子（CF）分析细胞收缩过程，发现stkP-K42M-7TE突变株的收缩曲线与 WT 相似，而stkP-K42M和stkP-K42M-7TA突变株存在细胞收缩阻断。这些结果表明 JMD 的磷酸化可补偿 StkP 活性的丧失，促进细胞收缩，即使在没有 StkP 底物磷酸化的情况下，JMD 的磷酸化也足以启动细胞收缩过程。
5. JMD 的磷酸模拟和去磷酸化形式均为内在无序结构：为探究磷酸模拟突变促进细胞收缩的分子机制，假设磷酸化可能影响 JMD 的结构组织或其与激酶结构域的相对位置。利用小角 X 射线散射（SAXS）研究 StkP 胞质结构域（包含 JMD 和催化结构域）的溶液结构，结果显示 JMD 具有无序和灵活的性质，且其磷酸化状态不显著改变其整体构象。通过液体核磁共振（NMR）实验进一步研究 JMD 的分子结构和动力学，发现 JMD 在两种磷酸化状态下均主要为无序结构，且 JMD 与激酶结构域不相互作用，其磷酸化也不影响二者的相对位置。
6. JMD 的磷酸模拟形式有利于招募细胞分裂机器中的蛋白质：假设 JMD 磷酸化可能影响 StkP 与其他细胞分裂相关蛋白质的相互作用，采用定量无标记质谱方法分析gfp-stkP-7TA和gfp-stkP-7TE菌株中与 StkP 共免疫沉淀的蛋白质。结果显示，gfp-stkP-7TA样本中未发现细胞分裂蛋白，富集的蛋白质主要参与代谢过程；而gfp-stkP-7TE样本中有 14 种细胞分裂相关蛋白显著富集，包括青霉素结合蛋白（PBPs）、肽聚糖修饰蛋白 PgdA、细胞分裂蛋白 FtsW、MreC、RodZ 等，以及一些调节蛋白。这表明 JMD 磷酸化促进了多种关键细胞分裂蛋白的招募，在协调和 / 或搭建分裂机器的组装中起重要作用。

讨论

本研究首次深入探究了肺炎链球菌丝氨酸 / 苏氨酸激酶 StkP 的 JMD 功能，发现 JMD 虽不是 StkP 自磷酸化的必需成分，但对女儿细胞的最终分离和大多数内源性底物的磷酸化至关重要。JMD 上的 7 个苏氨酸在体内可被磷酸化，其磷酸化影响分裂体的组装和细胞收缩，但不影响细胞最终分离。

与真核膜蛋白激酶不同，StkP 的 JMD 不太可能通过传递跨膜结构域的运动来激活激酶，也未发现其与催化结构域存在相互作用及由此产生的自抑制现象。本研究鉴定出的 7 个磷酸化苏氨酸与预测的 StkP 底物磷酸化基序不匹配，表明不同细菌蛋白激酶的 JMD 磷酸化位点可能不保守，存在独特的磷酸化编码或多个磷酸化事件来调节其功能。

虽然未发现肺炎链球菌中有 FHA 结构域蛋白与磷酸化 JMD 相互作用，但通过蛋白质组学分析发现磷酸模拟形式的 JMD 可促进细胞分裂蛋白的招募，表明存在尚未被鉴定的与磷酸化 JMD 相互作用的结构域或无需特定识别基序的相互作用方式。

JMD 磷酸化影响 StkP 和 FtsZ 在分裂隔膜定位的时间，触发早期细胞收缩，可能通过调节与其他分裂体成分的相互作用动力学来调控分裂机器的组装和拆卸。提出一个模型，即 StkP JMD 磷酸化促进分裂体中的相互作用网络，从而促进细胞收缩，而 PhpP 对 StkP 的去磷酸化则导致分裂体解离。

目前，细菌蛋白激酶领域仍处于起步阶段，对于 JMD 在激酶激活中的功能仍存在争议。未来，鉴定 JMD 的特定伙伴并表征相关复合物的结构组织，将有助于进一步理解 StkP JMD 磷酸化对细胞分裂和形态发生的贡献。