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为解决肽差向异构体难以鉴定的问题，来自国内（根据资助信息推测）的研究人员开展了通过离子淌度质谱（IM-MS）构建非共价复合物鉴别肽差向异构体的研究。他们用 IM-MS 分析肽差向异构体，构建与葫芦脲（CB）的复合物，成功鉴别多种肽差向异构体，为相关研究提供了新方法。
在生物体内，几乎所有蛋白质都由 L - 氨基酸（L-AA）构成，而 D - 氨基酸（D-AA）曾被认为不存在。直到 20 世纪 80 年代初，人们在南美树蛙皮肤分泌的阿片肽中发现了含生物活性 D - 氨基酸的肽（DAACP），随后在一些动物的毒液或神经组织的肽中也发现了不同位置的手性残基。更令人惊讶的是，在人体的游离形式或肽和蛋白质中也检测到了 D - 氨基酸。在与衰老相关的各种蛋白质（包括眼睛、皮肤和大脑）以及与白内障和阿尔茨海默病等疾病相关的组织蛋白质中，也发现了大量的 DAACP。残基的手性转变通常会导致肽或蛋白质的结构变化，甚至生理活性也会发生显著改变。例如，淀粉样蛋白中特定位置天冬氨酸的手性变化可能会诱导异常聚集或分解。一些由手性残基诱导的内源性神经肽可能表现出显著增强的受体结合亲和力或神经毒性。这些发现表明，深入了解手性残基的作用对于揭示相关生理或病理过程的机制、发现潜在疾病靶点或开发特定药物非常重要。
对 DAACP 的表征一直是一项具有挑战性的任务，因为手性残基不会引起肽的序列、等电点或质荷比等物理化学性质的任何变化。迄今为止，DAACP 的结构表征和残基鉴定主要基于质谱（MS）的蛋白质组学，并结合其他技术，包括液相色谱和离子淌度光谱（IMS）。高效液相色谱在 DAACP 的分离方面取得了显著成果，但通常需要较长的分析时间，且固定相选择困难。基于串联 MS 的解离技术用于 DAACP 的鉴定，依赖于关键敏感片段中离子的强度差异，包括碰撞诱导解离（CID）、电子捕获解离（ECD）和自由基导向解离（RDD）。IMS 是一种基于电场驱动下离子在中性气体中迁移行为差异来鉴别物质的技术。IMS 与 MS 联用（IM-MS）作为一种便捷高效的分析平台，提供了一个额外的维度 —— 碰撞截面（CCS），它可以进一步解析传统 MS 无法区分的有价值的结构信息。尽管取得了这些进展，但由于目前大多数仪器的分离性能有限，在保持高灵敏度的同时，仍然难以直接明确地解析肽差向异构体之间的细微结构变化。
在此，研究旨在开发一种通过 IM-MS 解析肽差向异构体结构并进行鉴别的方法，并进一步实现手性残基的快速定位。以甲硫氨酸脑啡肽（ME）和不同手性残基位置的肽差向异构体为模型进行概念验证。ME 差向异构体、低聚物和金属加合物证实了肽结构的差异。此外，葫芦脲（CB）家族具有对称的笼状结构，带有双开口端口，疏水空腔的笼效应和富含羰基的端口效应协同作用，使其能够与其他客体分子形成非共价复合物。ME 差向异构体与 CB 形成的特定复合物会产生构象特征分布的差异，其中 [ME+CB [8]+Li+H]2+产生集中且独特的特征，实现了对 ME 差向异构体的同时鉴别。理论计算揭示了非共价复合物中相互作用与结构差异之间的关系。该方法的适用性在多种神经肽和淀粉样截短肽中得到了验证。这项工作为基于超分子系统发现和识别天然复杂生物分子异构体开辟了前景。
样品制备：肽差向异构体、CB 和金属盐分别溶解在超纯水中，制成 100μM 的储备溶液，储存在 4°C 以备后用。分析时，将每种储备溶液用水稀释，得到最终浓度为 10μM 的肽差向异构体、CB 或金属盐溶液。
质谱和离子淌度分析：样品的所有质谱和离子淌度分析均在德国布鲁克道尔顿公司的捕获离子淌度飞行时间质谱仪（TIMS TOF MS）上进行。
直接分析肽差向异构体：脑啡肽作为最早发现的内源性活性阿片肽之一，是中枢神经系统中的一种吗啡样神经递质，也是外源性阿片类药物的天然模板。以甲硫氨酸脑啡肽（记为 ME-1）及其不同手性残基位置的肽差向异构体（记为 ME-2、ME-3 和 ME-4）为模型，用于后续的概念验证。质子化差向异构体 [ME+H]+（m/z=574.23）、二聚体 [2ME+H]+（m/z=1147.26）。
总之，通过 IM-MS 构建与 CB 的非共价复合物，开发了一种解析手性残基诱导的肽差向异构体结构并进行鉴别的通用策略。从作为概念验证的模型差向异构体到作为方法验证的神经肽的 IMS 分析表明，复合物中的 CB、金属离子和化学计量比可以调节代表性构象特征，从而放大结构差异以增强鉴别能力。
作者贡献声明：杜江龙：撰写原始草案、软件、方法学、调查、形式分析、数据整理、概念构思。杨舒童：验证、软件。褚艳秋：撰写 - 评审与编辑。颜英华：监督、资源。李振化：撰写 - 评审与编辑、资源。丁传凡：撰写 - 评审与编辑、监督、资源、项目管理、概念构思。
利益冲突声明：作者声明他们没有已知的可能影响本文所报道工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢：本研究得到了浙江省自然科学基金（LQ24B050001）和国家重点研发计划（2023YFF0724502）的支持。
