揭秘白色念珠菌白 - 不透明转换的转录调控密码：环境与菌株背景的双重影响

本文聚焦白色念珠菌（Candida albicans）白 - 不透明转换的转录调控机制。通过构建四环素诱导的转录因子（TFs）文库，发现 14 个 TFs 可诱导转换，且受菌株背景和培养基影响。这为理解真菌致病机制及开发新疗法提供了重要依据。

　　

引言

细胞分化对多细胞生物发育及单细胞微生物生存意义重大。白色念珠菌作为人体共生真菌，可在酵母态、菌丝态间转换，还能发生白 - 不透明转换。白色态为默认表型，不透明态可交配。该转换受转录因子网络调控，其中 Wor1 是不透明态主调控因子，其表达影响白色 - 不透明转换及相关表型，且转换受环境信号诱导。此前研究多基于基因敲除在单一菌株背景下进行，本研究则用全基因组方法在 WO-1 菌株背景下筛选过表达促进转换的 TFs，并在不同菌株和培养基中测试，以揭示转录调控机制。

结果

1. 四环素诱导的白色念珠菌 TF 文库构建与筛选：为系统寻找诱导白色 - 不透明转换的 TFs，将白色念珠菌已知或推定的 TFs 基因克隆到四环素诱导表达盒，构建超 300 个四环素诱导 TFs 文库，整合到 WO-1 菌株基因组，并提供给真菌遗传资源中心。筛选发现 8 个已知调控因子（Wor1、Wor2 等）和 4 个新调控因子（Rfx2、Rlm1 等）可诱导转换，且独立构建的表达特定 TF 的菌株表现相似，验证实验进一步证实了筛选结果。
2. 白色 - 不透明转换对调控因子 Wor1、Wor2 和 Czf1 的依赖性：在 WO-1 的wor1Δ、wor2Δ 和czf1Δ 突变体中过表达目标 TFs，发现所有 TFs 诱导转换均依赖 Wor1 和 Wor2，部分 TFs 诱导转换依赖 Czf1，部分则不依赖。
3. TF 基因缺失对白色 - 不透明转换的影响：成功构建ndt80Δ、rfx2Δ 等多个突变体，在厌氧条件下，ndt80Δ 突变体完全丧失形成不透明细胞能力，zcf21Δ 和zcf35Δ 突变体转换频率降低，回补野生型基因后恢复，其他突变体转换正常。
4. 转录因子过表达诱导转换的培养基依赖性：在不同培养基中比较 14 个诱导不透明的 TFs 诱导 WO-1 转换的能力，发现 TFs 诱导转换存在培养基特异性，可分为 “SCD 特异性”“Lee's 特异性” 和 “通用型”。如 Ndt80 和 Zcf35 在 SCD 培养基上转换频率高，在 Lee's^B培养基上低；Ofi1 则相反。混合培养基实验表明 SCD 和 Lee's 培养基特定成分影响转换。
5. 转录因子诱导白色 - 不透明转换的菌株依赖性：在 SC5314 的MTLa/a 衍生物中过表达 14 个 TFs，发现部分 TFs 在两菌株中诱导转换频率相似，部分则不同，且 TFs 在 SC5314 中诱导转换也存在培养基特异性，说明菌株背景和培养基均影响 TF 诱导转换频率。
6. 影响 TF 诱导转换的培养基成分：SCD 和 Lee's^B培养基氨基酸和酵母氮碱基（YNB）含量不同，补充氨基酸或 YNB 可改变 TF 诱导转换频率，且效果因 TF、培养基和菌株背景而异。如在 WO-1 中，补充氨基酸抑制 Ndt80 和 Ofi1 诱导的转换，促进 Zcf35 诱导的转换；补充 YNB 增强 Ndt80 和 Zcf35 诱导的转换。
7. pH 对 TF 诱导转换的影响：改变培养基 pH 影响 TF 诱导转换，酸性 pH 利于部分 TF 诱导转换，如 Ndt80 在 WO-1 的 SCD 培养基中 pH 5.5 时转换频率高于 pH 7 时；但 Ofi1 在中性 pH 下诱导转换更多。在 SC5314 中，多种 TF 在 SCD 培养基 pH 7 时转换频率低于 pH 5.5，Ofi1 和 Wor4 在 pH 7 时转换更多。
8. 锌对 TF 诱导转换的调控作用：前期筛选使用含锌的改良 Lee's 培养基，后续实验用不含锌的 Lee's^B培养基，发现锌浓度影响 TF 诱导转换。如 Ndt80 和 Zcf35 在含较高锌浓度水制备的 Lee's^B培养基或补充锌的培养基中可诱导 100% 转换，在低锌或无锌培养基中则不能。此外，Rfx2、Wor2 和 Wor4 在补充锌时诱导转换水平也更高。
9. 目标 TF 表达对细胞生长的影响：检测 TF 过表达菌株在不同培养基中的生长速率，发现部分 TF 过表达会降低菌株生长速率，且生长速率与转换频率无明显相关性。如在 SC5314 背景下，Cph1、Czf1 等 6 个 TF 表达菌株在两种培养基中生长速率均降低；在 WO-1 中，也有多个 TF 过表达菌株生长速率下降。
10. 菌株和培养基条件对 TF 表达水平的影响：通过构建 TF-mNeonGreen 融合蛋白表达菌株检测 Ndt80 和 Ofi1 表达水平，发现表达水平在不同实验和条件下有差异，部分差异与转换频率相关，但不能解释所有转换频率差异，如 Ndt80 表达水平与转换频率不相关。
11. 异位 TF 表达对白色 - 不透明转换核心 TF 调节因子的影响：对 WO-1 中表达 Ndt80、Rfx2 和 Zcf35 的菌株进行 Nanostring 基因表达分析，发现这些 TF 异位表达一般不改变核心网络 TFs 表达，Zcf35 仅使WOR1表达适度增加，表明它们独立于核心 TFs 影响转换。

讨论

1. 白色 - 不透明转换的转录调节因子：本研究构建并筛选 TF 过表达文库，确定 14 个可诱导白色 - 不透明转换的 TFs，包括 10 个已知和 4 个新调控因子。诱导转换需 Wor1 和 Wor2，且部分 TF 诱导能力与是否依赖 Czf1 有关。同时，Ndt80、Rfx2 和 Zcf35 不通过直接改变核心 TFs 表达诱导转换。
2. 环境因素和菌株背景对白色 - 不透明转换的影响：TF 功能对遗传和环境因素极为敏感，菌株背景（WO-1 与 SC5314）和培养基差异显著影响转换频率，且两者存在复杂相互作用。如 pH、锌、氨基酸和 YNB 对 Ndt80、Ofi1 和 Zcf35 诱导转换影响明显，且在不同菌株中作用不同。此外，Ndt80 在厌氧条件下对转换至关重要，其活性受环境信号影响，可能参与调控耐药性和生物膜形成。
3. 菌株背景对调控白色 - 不透明转换 TFs 的影响：不同白色念珠菌菌株在白色 - 不透明转换行为上存在差异，如 WO-1 在厌氧条件下转换增加，其他菌株则无此现象。SC5314 的MTLa/α 细胞因高表达 4 个 TFs 抑制转换，部分临床分离株因 Ofi1 表达增加而易于转换。同时，菌株在丝状化和生物膜形成方面也存在差异，且相关调控 TFs 与白色 - 不透明转换有重叠。
4. pH 和锌对 TF 诱导白色 - 不透明转换的影响：pH 影响白色念珠菌生物学过程，酸性 pH 促进部分 TF 诱导转换，但 Ofi1 在中性 pH 下诱导转换更多。锌对白色念珠菌生长、丝状化和白色 - 不透明转换有重要影响，一般促进生长和转换，抑制丝状化，且锌与 YNB 作用不同，多西环素可能影响锌的可用性，未来需用不同诱导启动子系统进一步研究锌在 TF 功能中的作用。
5. 结论：本研究拓展了调控白色 - 不透明转换的 TFs 种类，揭示 TF 功能受环境和菌株背景影响。转换对实验条件敏感，可能与 TFs 相分离有关。研究还凸显实验条件差异（如水的差异）对 TF 功能的影响，构建的 TF 过表达文库为深入研究白色念珠菌 TF 功能提供了重要工具。