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本文介绍了双有氧 - 无氧共培养（DOAC）技术，该技术突破传统局限，模拟体内环境，研究厌氧细菌（如具核梭杆菌 Fusobacterium nucleatum）与气道上皮细胞互作。发现 F. nucleatum 定植改变自身基因表达，上皮细胞呈现细胞类型特异性转录反应，为气道疾病研究提供新思路。
双有氧 - 无氧共培养技术的研发背景
长期以来，临床实验室培养多聚焦于少数与急慢性气道疾病相关的病原体，如铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。近年来，不依赖培养的测序研究发现，气道微生物群存在复杂的细菌特征，提示多微生物疾病病因。其中，口腔相关的兼性和专性厌氧菌，如具核梭杆菌（Fusobacterium）、普雷沃菌属（Prevotella）、韦荣菌属（Veillonella）、链球菌属（Streptococcus）等，在健康呼吸道中密度较低，但在慢性阻塞性肺疾病（COPD）、囊性纤维化（CF）、非 CF 支气管扩张、鼻窦炎、呼吸机相关性肺炎等呼吸道疾病中普遍且大量存在。
在疾病发展过程中，气道上皮界面的低氧微环境为厌氧菌的增殖创造了条件，其密度常可达到甚至超过典型病原体。然而，厌氧菌对气道疾病的致病机制尚不清楚。在健康个体中，支气管肺泡灌洗液中厌氧菌的丰度与促炎细胞因子的表达、Th17 淋巴细胞的升高以及 toll 样受体 4（TLR4）反应的减弱有关，这意味着宿主对细菌感染的第一道防线可能受损。在不同疾病状态下，厌氧菌也发挥着不同作用。在非 CF 支气管扩张中，Prevotella 和 Veillonella 与 Th17 细胞因子和非结核分枝杆菌感染呈正相关；在 HIV 感染者中，厌氧菌通过产生短链脂肪酸（SCFAs）抑制干扰素 γ 和白细胞介素 - 17A（IL - 17A）的表达，削弱宿主对结核分枝杆菌定植的反应；在 CF 患者中，厌氧菌产生的 SCFAs 随年龄和疾病进展而增加，可介导支气管上皮细胞过度产生 IL - 8，促进中性粒细胞动员，还能增强典型气道病原体的生长和毒力 。不过，厌氧菌在疾病发作时数量增加，且与较轻疾病相关，其在发病机制中的具体作用仍有待明确。
目前，直接研究厌氧菌与宿主以及厌氧菌与宿主 - 病原体之间的相互作用受到限制，主要原因是缺乏合适的实验室模型。动物模型往往不能很好地反映慢性感染病理，且高通量分析成本高昂；三维（3D）细胞培养虽扩展了对微生物 - 上皮相互作用的认识，但在缺氧或无氧条件下维持宿主细胞活力存在挑战；新型微流控和器官芯片技术虽能建立低氧或无氧上皮界面，但技术要求高，需要专门仪器。因此，开发更易获取、通用的体外研究方法对深入了解厌氧菌及其在慢性气道疾病中的潜在作用至关重要。
双有氧 - 无氧共培养技术的建立与优化
为解决上述问题，研究团队开发并优化了双有氧 - 无氧共培养（DOAC）平台。首先，在标准（常氧）条件下，将腺癌 Calu - 3 细胞系在 Transwell 小室的气液界面（ALI）培养 21 - 28 天，使其形成极化单层，该单层在顶端表面产生明显的黏液层，模拟 CF、COPD、鼻窦炎等慢性气道疾病中异常的黏蛋白积累。
极化后的 Calu - 3 细胞所在的 Transwell 小室被放置在定制的 3D 打印热塑性聚氨酯垫圈上，该垫圈安装在 24 孔透气培养板上，随后转移到厌氧工作站内的培养箱中。在培养箱内，混合血气（21% O2、5% CO2、74% N2）通过安装在含有 Transwell 装置基底外侧隔室的电缆接头输送和排出，这样的设置旨在使宿主细胞获得氧气供应的同时，让顶端上皮表面暴露在厌氧箱的低氧环境中，以促进厌氧菌的生长。
研究人员利用光纤氧微传感器对不同条件下 Transwell 小室内的氧气浓度进行了检测。结果显示，在常氧条件下，Calu - 3 细胞黏液层中的氧气浓度从 21%（饱和）下降到约 16%；而在 DOAC 条件下，上皮表面的氧气浓度低于检测限（0.3%）。在不含上皮细胞的空孔中，可检测到在 Transwell 膜上方几百微米处存在逐渐变化的氧梯度，这表明在 DOAC 系统中，汇合的上皮层足以限制氧气扩散到顶端环境。
进一步评估 DOAC 性能时发现，与常氧和严格厌氧（即不供应 O2）条件下的细胞培养相比，Calu - 3 细胞在 DOAC 条件下培养 24 h 内的细胞毒性可忽略不计，48 h 和 72 h 后细胞死亡逐渐增加。永生的 RPMI 2650 鼻上皮细胞系和原代人气管支气管上皮细胞在 DOAC 条件下也至少能维持 24 h 的活力，适用于多种上皮细胞类型。在 24 h 时，DOAC 对 Calu - 3 细胞生理学影响较小，跨上皮电阻（TEER）和 E - 钙粘蛋白浓度与常氧对照无差异，免疫荧光显微镜显示细胞紧密连接蛋白染色良好，且 DOAC 条件下 IL - 6 和 IL - 8 的产生无显著增加，表明 24 h 内降低的顶端氧浓度不会引发 Calu - 3 细胞的炎症反应。
通过对 Calu - 3 细胞进行批量 RNA 测序发现，培养 24 h 时，转录组分析显示约 16,000 个基因中有 148 个差异表达转录本（117 个上调，31 个下调，log2 倍数变化 [l2fc] ≥ 1，Padj < 0.001）；48 h 时，3,737 个基因差异表达（2,816 个上调，921 个下调），这与 48 h 时细胞毒性增加相吻合。除了缺氧诱导的 ANGPTL4 和急性炎症诱导的 SERPINA1 外，24 h 时细胞应激相关标记物差异表达较少，缺氧诱导因子 - 1α（HIF - 1α）在两种环境下表达一致，表明 DOAC 条件下 Calu - 3 细胞氧合充足。在炎症生物标志物中，只有 ICAM1 和 TGFβ1 有统计学差异，进一步证明 DOAC 不会产生明显的炎症微环境。此外，不同培养条件下黏蛋白相关基因表达无显著差异。综合来看，DOAC 虽会引起细胞毒性和基因表达的一些变化，但相对于其在模拟厌氧微生物与宿主相互作用方面的优势，这些变化可忽略不计。
双有氧 - 无氧共培养技术用于研究厌氧菌与上皮细胞的共培养
此前，由于缺乏与低氧或无氧细菌生长兼容的上皮细胞培养系统，限制了对厌氧菌与宿主相互作用的理解。已知厌氧细菌的培养上清液可通过产生 SCFAs 诱导气道上皮细胞表达促炎细胞因子，但宿主对上皮界面直接存在的厌氧菌的反应，以及厌氧微生物如何响应上皮微环境改变自身行为尚不清楚。
为填补这一知识空白，研究人员利用 DOAC 技术评估 Calu - 3 细胞与具核梭杆菌（F. nucleatum）之间的相互作用。F. nucleatum 是一种专性厌氧的致病共生菌，常见于口腔健康和疾病状态，也可定植于口腔外部位，如气道，与 COPD、CF、鼻窦炎、吸入性肺炎等疾病的发病机制相关，还与炎症性肠病、结直肠癌、胃食管反流病等有关，因此被选作测试 DOAC 系统的代表性细菌。
在 DOAC 条件下平衡 3 h 后，用约 2 × 106 集落形成单位（CFU）的 F. nucleatum 亚种 F. nucleatum ATCC 25586 感染极化的 Calu - 3 细胞，并在厌氧箱中再孵育 24 h。由于 F. nucleatum 的荧光标记有限，研究人员使用杂交链式反应荧光原位杂交（HCR - FISH）成像技术来观察其在顶端界面的定植情况。结果显示，24 h 后，F. nucleatum 在 Calu - 3 细胞表面形成异质的附着排列，从单个细胞到密集的细胞簇不等，但未观察到其侵入上皮细胞。通过洗涤顶端表面并在选择性培养基上培养，24 h 后回收了存活的细菌细胞（7 × 106 ± 2 × 106），同时在培养介质中检测到微生物衍生的短链脂肪酸，如乙酸（4.0 μM）、丁酸（7.0 μM）和丙酸（0.8 μM），而未感染的对照培养物中未检测到，这证实了顶端氧浓度足够低，有利于厌氧菌的存活和发酵代谢。与典型气道病原体金黄色葡萄球菌不同，F. nucleatum 定植仅对 Calu - 3 细胞产生轻微（但具有统计学意义）的细胞毒性。
F. nucleatum 在与 Calu-3 细胞厌氧共培养时改变其全局转录谱
鉴于 F. nucleatum 在侵袭 Caco - 2 上皮细胞过程中会差异调节参与氨基酸代谢、蛋白质输出和毒力的基因表达，研究人员推测其在定植 Calu - 3 细胞界面时会表达独特的转录谱。因此，在 DOAC 条件下，用 F. nucleatum 感染培养有 Calu - 3 细胞的 Transwell 小室 24 h，同时平行培养浮游菌作为对照。提取总 RNA，进行核糖体 RNA 去除后进行 Illumina 测序，将序列读数映射到 F. nucleatum 亚种 F. nucleatum ATCC 25586 基因组上，并使用 DESeq2 进行差异基因表达分析。
结果表明，与浮游培养相比，上皮定植期间有 181 个基因差异表达（117 个上调，31 个下调，l2fc ≥ 1，Padj <0.001，每个基因映射序列读数> 10）。在差异表达最显著的基因中，FN1885 编码溶血素 III，与 Fusobacterium animalis 中的一种溶血素（FSDG_RS08715）有 96% 的同一性，在肠道上皮侵袭时会上调。其他上调基因包括 FN1590（假定的毒力脂蛋白）、FN0622（DNA 裂解酶）、FN0658（ABC 转运体底物结合蛋白 MetQ）等。下调基因中，包括 nik 操纵子的四个基因（FN1500、FN1501、FN1502、FN1503），其编码周质结合蛋白依赖性转运系统，类似基因在大肠杆菌和奇异变形杆菌中的破坏会降低含镍酶活性和毒力。FN1868（kce）和 FN1867（kdd）编码的酶也下调，可能反映了从浮游生长时的赖氨酸发酵转变为定植时的丁酸产生的替代代谢过程和途径。
进一步分析发现，许多差异表达基因与中央代谢和转运相关。上调基因中，有多个与乙醇胺（EA）分解代谢有关，如 eutB（FN0079）和 eutC（FN0080）编码 EA 氨裂解酶的亚基，可将 EA 分解为氨和乙醛，乙醛再通过乙醛脱氢酶（FN0089，也上调）转化为乙酰辅酶 A，这与培养基中短链脂肪酸的产生一致。其他上调过程包括甲硫氨酸转运和利用、一些调节蛋白以及与毒力相关的脂蛋白和共伴侣蛋白等。同时，除 nik 和 dpp 操纵子外，参与寡肽摄取的 OppABCDF ABC 转运系统也显著抑制。综合来看，F. nucleatum 在定植上皮细胞时，通过改变代谢和转运过程来优化对生物可利用营养源的利用，同时增加可能有助于其致病性的信号和毒力途径的表达。
单细胞 RNA 测序揭示细胞对 F. nucleatum 的特异性反应
转录组研究上皮细胞群体时，批量 RNA 测序会平均不同宿主细胞类型对整体转录景观的贡献，掩盖生理过程在细胞间的分布情况，且罕见细胞类型的贡献难以显现。单细胞 RNA 测序（scRNAseq）在呼吸研究中得到广泛应用，已发现离子细胞等，并对肺癌免疫景观、CF 肺部单核吞噬细胞以及宿主对严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 感染的反应有了新认识，但尚未应用于气道疾病背景下的细菌 - 宿主相互作用研究。
研究人员将 DOAC 与 scRNAseq 相结合，以探究 F. nucleatum 是否会引发因上皮细胞类型而异的炎症宿主反应。首先，在常氧条件下，用 Pneumacult 培养基在 ALI 培养原代人支气管上皮（nHTBE）细胞，通过流式细胞术确认其分化为纤毛细胞、基底细胞和分泌细胞（包括杯状细胞）。培养约 21 天后，将细胞转移到 DOAC 条件下平衡 3 h，然后用 F. nucleatum 进行顶端感染。24 h 共培养后，使用 10X Genomics Chromium 控制器捕获 nHTBE 细胞并进行测序。
经过数据处理和分析，通过统一流形近似和分区（UMAP）将细胞分为 13 个不同的簇，这些簇在处理和未处理样本集中无明显差异。通过识别每个簇中显著上调的基因并与经典上皮细胞类型的标记基因集比较，确定了每个簇的细胞类型。研究发现，不同细胞类型特异性表达 17 种模式识别受体（PRRs），如 TLR2 主要在分泌细胞中表达，NOD1 和 NLRP1 分别在纤毛细胞和基底细胞中表达较高，这支持了宿主对细菌挑战的反应具有细胞类型特异性的假设。
利用 DESeq2 进行差异基因表达分析，发现 F. nucleatum 处理的细胞与未处理的对照相比，不同细胞类型呈现出不同的反应：基底细胞有 34 个基因上调、21 个基因下调；纤毛细胞有 217 个基因上调、23 个基因下调；分泌细胞有 77 个基因上调、10 个基因下调（Padj < 0.001）。F. nucleatum 刺激多种细胞因子和趋化因子的表达，如纤毛细胞中的 CCL15 和基底细胞中的 CXCL17。此外，F. nucleatum 挑战还导致与细胞增殖、侵袭和粘附相关的基因和途径差异表达，如 CYP1B1、GSTA1、HSPA1A、HSPA6 等在不同细胞类型中均上调，还有 21 个其他癌症相关基因也因细胞类型而异（Padj < 0.001）。这些数据首次以 scRNAseq 的精细度揭示了气道上皮对细菌挑战的反应，进一步证明了 DOAC 平台在模拟厌氧菌 - 宿主相互作用方面的强大功能。
双有氧 - 无氧共培养技术的优势、局限与展望
尽管厌氧菌是气道微生物群的重要组成部分，但对其在疾病病理生理学中的作用研究结果存在矛盾，主要原因是缺乏合适的模型来测试其与呼吸道上皮的相互作用。DOAC 平台的出现解决了这一难题，它能够实现专性厌氧菌与极化气道上皮细胞的共培养，通过仅向宿主细胞基底侧提供氧气，避免了缺氧相关的细胞毒性、炎症和全局基因表达的显著变化，为研究厌氧菌 - 宿主相互作用提供了有力工具。利用该平台，研究发现 F. nucleatum 在上皮表面定植时会改变转录谱，同时引发宿主不同上皮细胞类型的促炎和增殖反应。
与其他共培养系统相比，DOAC 具有诸多优势。传统的 Transwell 培养用于研究厌氧微生物与上皮细胞相互作用时，存在孵育时间短或模拟体内条件不充分的问题；新型微流控和器官芯片模型虽能建立双有氧 - 无氧界面，但存在技术要求高、难以维持氧微环境或无法实现宿主 - 细菌直接接触等局限性。而 DOAC 操作简便，宿主与微生物可直接相互作用，采用多孔板格式具有良好的可重复性，且方法灵活，适用于生化、显微镜和转录组研究。不过，DOAC 目前也存在一定局限，共培养时间仅能维持约 24 - 48 h，可能是由于有毒代谢产物积累、生长培养基逐渐酸化、ATP 生成不足和长时间厌氧糖酵解等原因。研究人员正在通过改进培养条件，如更换培养基、增加气体供应和改变上皮细胞类型等，来延长培养时间，深入研究宿主与厌氧微生物之间的持续相互作用。
在研究 F. nucleatum 与气道上皮细胞相互作用的过程中，发现 F. nucleatum 在从浮游生长转变为上皮定植时，基因表达发生了显著变化，这可能反映了其在气道初始定植时的行为。定植过程刺激了肽、氨基酸和无机离子的转运，促进了代谢多样化，同时可能通过调节赖氨酸发酵和 EA 代谢来影响其在宿主细胞表面的聚集和生物膜形成，还上调了一些毒力因子的表达。选择 Calu - 3 细胞作为代表细胞系进行研究，是因为其在 ALI 培养时极化快、TEER 值高且稳定，顶端表面黏液过度产生可模拟疾病黏膜环境，但 Calu - 3 细胞也存在局限性，它与原代细胞在结构和对外部刺激的反应上存在差异，因此需要使用 DOAC 平台结合更多细胞系和原代组织进行研究。
DOAC、原代支气管上皮细胞和 scRNAseq 的联合应用，揭示了宿主对 F. nucleatum 挑战的细胞类型特异性转录
