铜螯合剂对白色念珠菌出芽的抑制作用：新型抗真菌药物的探索

本文聚焦白色念珠菌（Candida albicans），研究发现放线菌代谢物 SF2768 能干扰其形态转变，抑制出芽。机制研究表明，SF2768 通过螯合铜离子发挥作用，铜离子在念珠菌出芽中起促进作用。该研究为开发新型抗真菌药物提供了方向。

　　

研究背景

随着人口老龄化和先进医疗需求的增加，机会性感染尤其是真菌感染的发病率迅速上升。念珠菌病是临床常见的真菌疾病，由念珠菌属（Candida spp.）引起。目前治疗念珠菌病的药物主要有棘白菌素类、唑类、多烯类和嘧啶类似物四类，但这些药物在抗真菌效力、抗菌谱和副作用方面存在问题，且多药耐药真菌的出现，如耳念珠菌（Candida auris），对全球健康构成了严重威胁。

白色念珠菌具有独特的 “双态性”，能在单细胞出芽酵母和丝状菌丝形态之间转换，这种形态变化在疾病发展的各个阶段，包括黏附、侵袭、免疫逃逸和宿主反应中都发挥着重要作用。尽管白色念珠菌的形态变化受环境因素（如 pH、CO₂、营养物质可用性、血清）和细胞密度（群体感应分子：法尼醇和酪醇）的影响，但其双态性的分子机制仍不明确。研究表明，锁定在酵母或菌丝状态的突变体在小鼠模型中无致病性，这使得白色念珠菌酵母和菌丝形态之间的转换成为药物开发的有吸引力的靶点。

天然产物中蕴含着具有独特生物和结构特性的化合物，许多已成为新药和生物探针的基础。研究人员建立了筛选平台，包括微生物收集、组分库、NPPlot 和基于 OSMAC 的筛选方法，还构建了两种基于细胞表型的筛选方法：iHOPE 和 MorphoBase，已发现了多种独特的生物活性化合物。本研究旨在利用这些筛选平台，识别干扰白色念珠菌双态性的小分子，为此开发了白色念珠菌形态数据库（cMorphoBase）。

实验结果

1. 筛选白色念珠菌双态性调节剂：构建 cMorphoBase 时，研究人员考察了十多种作用机制已知的抗真菌药物对白色念珠菌形态的影响，发现这些化合物根据其作用机制诱导出独特的形态变化，可大致分为富酵母型和富菌丝型。在筛选放线菌和真菌的培养液时，发现放线菌菌株 RK13 - S276 的培养液能抑制白色念珠菌 JCM1542 的生长，并使其形态变为高度伸长和扭曲的菌丝状。通过多种色谱方法对培养液的乙酸乙酯提取物进行纯化，得到 RK - 276A，经质谱（MS）和核磁共振（NMR）数据分析，其平面结构与已知的二异氰化物抗生素 SF2768 一致，虽当时未确定 SF2768 的立体化学结构，但基于比旋光度预测 RK - 276A 与 SF2768 相同。
2. SF2768 抑制白色念珠菌出芽：iHOPE 测定显示，SF2768 对白色念珠菌具有强效抗真菌活性，IC₅₀值为 0.010 μM，效力与现有抗真菌药物如两性霉素 B 和米卡芬净相当，且对烟曲霉（Aspergillus fumigatus）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）也有抗真菌活性，对 HL - 60 细胞在高达 30 μM 浓度下无细胞毒性（选择性指数＞3000）。在 MOPS - RPMI 培养基中，白色念珠菌会发生从酵母到菌丝再到酵母的形态转变，而 SF2768 处理后，细胞在形成假菌丝前的生长与对照（二甲基亚砜，DMSO 处理）相似，但分支和侧生酵母很少，菌丝生长也极少。洗去药物后，白色念珠菌恢复活跃的菌丝分支和侧生酵母出芽，表明 SF2768 是一种独特的、可逆的化合物，抑制菌丝向酵母的转变。法尼醇是白色念珠菌产生的群体感应分子，能抑制菌丝生长，使细胞在菌丝生长条件下以酵母形式生长。SF2768 能抑制法尼醇诱导的酵母生长，这表明 SF2768 广泛抑制念珠菌出芽，不仅在菌丝向酵母转变过程中，也在酵母生长过程中。此外，SF2768 对非白色念珠菌如光滑念珠菌（C. glabrata）JCM3761、热带念珠菌（C. tropicalis）JCM1541 和耳念珠菌（Ci6684 和 VPCI 673/P/12）也有显著的生长抑制作用，尽管耳念珠菌对氟康唑高度耐药，但 SF2768 对其仍有几十纳摩尔的 IC₅₀值。
3. 铜离子耗竭是 SF2768 抗真菌作用的机制：由于 SF2768 诱导的表型与 cMorphoBase 中靶向蛋白质的抗真菌药物不匹配，研究人员推测其可能靶向蛋白质以外的分子。之前发现的铁螯合剂 collismycin 的处理表型与 SF2768 相似，且有报道称 SF2768 能以 2:1 的化学计量比特异性结合铜，其铜螯合活性对革兰氏阳性细菌的抗菌活性很重要。研究发现，铜离子与 SF2768 形成复合物后完全消除了其抗真菌活性，添加过量的其他金属离子（如铁、锌、锰、镁）不影响 SF2768 的活性。其他铜螯合剂，如用于治疗威尔逊病（一种以铜过度沉积为特征的常染色体隐性遗传病）的 D - 青霉胺和曲恩汀，也对白色念珠菌具有抗真菌活性，且诱导的形态变化与 SF2768 相似。在真菌培养物中添加铜离子，尤其是浓度为 1 μM 或更高时，会使白色念珠菌更早出芽，促进其向酵母形态转变。向被 SF2768 剥夺铜离子的白色念珠菌中添加铜离子，可使广泛伸展的菌丝恢复酵母出芽。进一步研究发现，SF2768 在显著诱导形态变化的剂量范围内（0.010 - 0.3 μM），不改变念珠菌属细胞内 ATP 和活性氧（ROS）的水平，其他铜螯合剂也不诱导 ROS 产生。线粒体电子传递抑制剂（如细胞色素 c 氧化酶（CcO）抑制剂硝普钠和 ROS 诱导剂 H₂O₂）诱导的表型与铜螯合剂完全不同，这表明可能存在另一种参与念珠菌出芽的铜依赖性蛋白质。
4. SF2768 合成衍生物的生物活性：为确定 SF2768 的绝对立体化学结构并开发更有效的衍生物，研究人员进行了合成研究。以（R） - 3 - 氨基丁酸和（S） - 3 - 氨基丁酸为起始原料，分别制备了锂（R） - 3 - 异氰基丁酸酯（7a）和锂（S） - 3 - 异氰基丁酸酯（7b），然后与二胺进行偶联反应，得到了一系列单酰胺（8）和二酰胺（10、12、13、14、15、16）。对这些衍生物进行结构 - 活性关系（SAR）研究，评估其对白色念珠菌的抗真菌活性、诱导形态变化的活性以及对 HL - 60 细胞的细胞毒性。结果表明，单酰胺（8a 和 8b）抗真菌活性和抑制出芽的能力较弱，二酰胺（10a 和 10b）比单酰胺效果更强。不含异氰基的 2 - 丁烯酰和丁酰衍生物（9 和 11）对念珠菌的存活率和形态没有影响，说明异氰基是这类化合物活性的关键。优化侧链长度发现，2 - （4 - 氨基苯基）乙胺（n = 2）衍生物（12a 和 12b）比 4 - 氨基苄胺（n = 1）衍生物（10）活性更强，与 SF2768（1）活性相近，而对苯二胺和间苯二胺衍生物（13b、14a 和 14b）的活性比 SF2768 低 2 - 5 倍。顺式 - 1,4 - 环己二胺衍生物（15）活性略低于 SF2768 和 12，但仍保留几十纳摩尔的效力，反式 - 1,4 - 环己二胺衍生物（16）比 15 弱 30 倍。虽然具有（S） - 异氰基（天然类型）的异构体有时比（R） - 异构体活性更强，但大多数衍生物无论异氰基构型如何，活性几乎相同，说明异氰基的手性对效果影响不大。SAR 研究表明，12 和 15 虽然不如 SF2768 活性强，但在合成衍生物中活性最强。它们与 SF2768 相似，能将白色念珠菌转化为菌丝形态，对包括耳念珠菌在内的多种念珠菌属具有强效抗真菌活性，且在 30 μM 浓度下对 HL - 60 细胞无细胞毒性。

讨论

本研究从微生物代谢物中鉴定出放线菌代谢物 SF2768/RK - 276A，它能诱导白色念珠菌形态变化。详细的时间 - lapse 显微镜分析显示，SF2768 抑制 MOPS - RPMI 培养基中（假）菌丝上侧生酵母的出芽，从而抑制菌丝向酵母的转变，还能抑制在促进酵母生长条件下（含法尼醇的 MOPS - RPMI 培养基）酵母细胞的出芽。此前研究多关注影响白色念珠菌酵母向菌丝转变的化合物，而 SF2768 和其他铜螯合剂是首次发现的抑制酵母 / 侧生酵母出芽的抑制剂，其作用机制有待进一步研究。白色念珠菌 pescadillo 同源物 PES1 对白色念珠菌菌丝形成侧生酵母是必需的，评估 SF2768 对 PES1 活性的影响应是首要解决的问题。

金属离子参与几乎所有生物体的生物过程调节。铁离子是多种与 DNA 合成和电子传递链相关酶的活性中心，在念珠菌属的生长、致病性和感染中起重要作用。宿主血液中游离铁离子很少，真菌通过产生铁载体获取铁离子，铁稳态被认为是抗真菌药物的有前景的靶点，铁螯合剂与氟康唑联合使用对唑类耐药念珠菌有显著协同作用。

铜离子是生物体必需的微量元素，参与铁稳态、铁摄取和转运体表达的调节，也与白色念珠菌的双态性调节有关。已有研究表明，添加氯化铜可抑制 37°C 培养的白色念珠菌的丝状化，铜转运蛋白 CaCtr1 缺失突变体表现出与铜摄取缺乏一致的表型和改变的菌丝形态。本研究进一步证实铜本身在促进酵母生长方面的作用与法尼醇相似。然而，受 SF2768 影响并负责酵母出芽的铜蛋白尚未确定。铜代谢涉及多种关键分子，包括控制细胞内铜水平的转运体（CTR1 和 CCC2）、伴侣蛋白（ATX1 和 COX17）、解毒蛋白（金属硫蛋白）、铜依赖性转录因子（MAC1 和 ACE1）和铜酶（SOD1 和 CcO）。虽然有研究提出 SF2768 导致的铜缺乏会扰乱 CcO，这可能是其抗菌作用的机制，但本研究发现这不是其抗真菌作用的机制。基因组转录谱分析显示，Sod5 是白色念珠菌酵母向菌丝转变过程中上调的基因之一，对感染小鼠模型的致病性是必需的，但目前关于铜蛋白参与酵母出芽的报道较少，对 SF2768 及其类似物的化学生物学研究将有助于发现参与出芽的铜蛋白。

目前，多药耐药念珠菌属（如耳念珠菌和光滑念珠菌）的全球传播引起了广泛关注。SF2768 对这些菌株的抑菌作用为未来药物开发提供了有前景的潜力。但铜螯合剂并不总是有效，曲恩汀和 D - 青霉胺的抗菌谱与 SF2768 略有不同。这可能是因为它们对铜的亲和力较低，金属特异性降低，或可能通过胺或硫醇官能团非特异性结合蛋白质。而含有异氰基的 SF2768 与铜离子具有强且高度特异性的结合能力。另一个原因可能是药物外排或摄取的差异，耳念珠菌常通过多种机制对主要抗真菌药物产生耐药性，包括典型抗真菌药物靶基因突变和药物转运体激活，曲恩汀和 D - 青霉胺对耳念珠菌完全失去活性，而 SF2768 仍然有效，表明 SF2768 可能绕过了该菌株的耐药机制。值得注意的是，SF2768 是唯一诱导形成特征性正弦菌丝的化合物，其诱导蜿蜒生长的机制可能与铜螯合不同，正常情况下白色念珠菌菌丝直线生长，而当 Ca^{2 +}信号被破坏或微管组织和极化肌动蛋白组装缺陷的突变体中，菌丝会呈现正弦或螺旋生长，这表明 SF2768 可能影响白色念珠菌的这些细胞过程。自然界和实验室中已鉴定出数千种含异氰基的化合物，其中一些具有独特的生物活性，如抗真菌的 A32390A 在体内模型中显示出潜在活性。虽然目前含苯环 / 环己烷环的 SF2768 类似物的活性仍不如天然的 SF2768，但相信具有更高和更特异性螯合活性的其他类似物将成为抗真菌药物的种子和分析白色念珠菌铜离子调节出芽的有用生物探针。

材料和方法

1. 化合物：SF2768 从放线菌菌株 RK13 - S276 的发酵液中分离得到，其衍生物根据相关文献报道的方法制备。抗真菌标准品（两性霉素 B、氟康唑、米卡芬净和 5 - 氟胞嘧啶）、线粒体呼吸抑制剂（抗霉素 A、寡霉素 A 和粉蝶霉素 A）由 RIKEN Chemical Bank NPDepo 提供。法尼醇、D - 青霉胺、硝普钠二水合物和曲恩汀盐酸盐购自德国默克公司，H₂O₂购自日本富士胶片和光纯药株式会社。
2. 测试微生物：使用的微生物包括大肠杆菌（Escherichia coli）HO141、烟曲霉 Af293、金黄色葡萄球菌 209P、白色念珠菌 JCM1542、光滑念珠菌 JCM3761、热带念珠菌 JCM1541、耳念珠菌（Ci6684 和 VPCI 673/P/12）和稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）Kita - 1。其中，部分菌株由 RIKEN BRC 通过日本文部科学省 / 日本医疗研究开发机构的国家生物资源项目提供，耳念珠菌菌株由相关研究人员赠送，稻瘟病菌 Kita - 1 来自日本农业生物资源研究所基因库。
3. 哺乳动物细胞：人早幼粒细胞白血病细胞系 HL - 60 RCB0041 购自 RIKEN BRC，在添加 10% 胎牛血清的罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI） - 1640 培养基中，于 37°C 培养。
4. 晕圈试验：采用自动分配器进行晕圈试验，方法在先前文献基础上略有修改。将白色念珠菌 JCM1542 菌株培养至饱和后，取 0.5 mL 预培养物加入 50 mL 麦芽琼脂中，制备接种平板。用 BioTec ADS384 机器人将 0.1 μL 每种培养液提取物转移到接种平板上。
5. iHOPE（内部表型评估）试验：体外细胞毒性评估使用 Cell Count Reagent SF，抗菌试验基于 CLSI 标准微量稀释法。对于念珠菌属，将含有 0.1% 0.5 麦氏标准悬液的 MOPS - RPMI 培养基接种到多孔板中，加入测试化合物后，于 28°C 孵育 24 h。使用 Varioskan LUX 多功能酶标仪测量微生物培养物在 600 nm 处的浊度（OD600），使用一体化荧光显微镜 BZ - X810 获取明场图像，使用配备时间 - lapse 模块、载物台培养箱和温度控制器的 BZ - X810 仪器进行活细胞成像。

致谢

研究人员感谢相关研究人员提供耳念珠菌菌株，以及 RIKEN 的多位研究人员在实验分析、样品制备、实验操作和统计分析等方面提供的帮助。本研究得到了多项科研经费的支持，包括科学研究资助（KAKENHI）、RIKEN 化学探针项目和 RIKEN 激励研究项目。