利用铁剥夺效应抑制机会致病菌鲍曼不动杆菌生长的研究及意义

本文聚焦鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii），该菌是免疫低下患者中的高传染性致病菌，耐药问题严峻。研究发现铁对其生存至关重要，铁螯合剂 β- 崖柏素（β-thujaplicin）能抑制其生长、破坏生物膜和抑制持留菌。且 β-thujaplicin 与抗生素联用可增效，为抗耐药菌感染提供新思路。

　　### 研究背景
鲍曼不动杆菌是重要的革兰氏阴性球杆菌，广泛存在于环境中，被世界卫生组织列为全球医院感染中最棘手的病原体之一。它能对包括碳青霉烯类和粘菌素等最后一线抗生素产生耐药性，是医院收治患者局部和全身感染的主要原因，尤其威胁免疫功能低下人群。从分子和生理角度来看，毒力因子进化、生物膜形成、固有药物靶点改变以及持留菌形成，共同导致了抗生素耐药问题的加剧，因此寻找新的治疗策略迫在眉睫。

铁是所有细菌病原体生存必需的微量元素，在细菌代谢中发挥关键作用，参与氧气运输、呼吸、DNA 复制修复和基因表达等重要过程。在宿主环境中，由于铁与生物分子紧密结合，且 Fe²⁺易氧化为 Fe³⁺并形成不溶性金属氢氧化物，导致游离铁浓度极低，细菌获取铁面临挑战。鲍曼不动杆菌进化出多种铁摄取机制，包括直接结合 Fe²⁺或血红素，以及分泌铁载体（如 Acinetobactin、Baumannoferrin 和 Fimsbactins）来竞争摄取铁。

基于微生物铁摄取机制，使用铁螯合剂干扰细菌铁代谢成为一种有前景的抗菌策略。本研究旨在探究多种铁螯合剂对鲍曼不动杆菌生长生理的影响机制，为开发新型抗菌疗法提供依据。

实验材料与方法

实验使用鲍曼不动杆菌菌株（DS002），从 MTCC 获取。实验材料包括多种化学试剂、抗生素、试剂盒等。

实验方法涵盖多个方面：采用肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC），确定不同试剂抑制细菌生长的最低浓度；通过在含不同铁螯合剂的培养基中培养细菌，测量光密度（OD）和菌落形成单位（CFU），分析细菌生长和存活情况；在铁螯合剂存在下培养细菌，经固定、染色等步骤，测定生物膜含量；用不同浓度 β- 崖柏素处理细菌，检测 N - 苯基 - 1 - 萘胺（NPN）荧光强度，分析细菌细胞膜通透性；利用 2′?7′- 二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFDA）染料检测细菌胞质中活性氧（ROS）的产生；通过台盼蓝染色，在显微镜下观察细菌细胞活力；用扫描电子显微镜观察细菌细胞形态变化；经多步培养和处理，测定持留菌生成情况；提取细菌 RNA，反转录为 cDNA 后进行实时定量 PCR，分析基因表达；进行铁补充实验，观察细菌生长恢复和 ROS 产生变化；用 MTT 法检测 β- 崖柏素对 C2C12 细胞系的细胞毒性。

实验结果

1. 不同螯合剂的抗菌效果：通过生长曲线和 CFU 分析发现，β- 崖柏素抑制鲍曼不动杆菌生长的效果最佳，在 100 μM 浓度下就能显著抑制细菌生长，而 2,2′- 联吡啶（DIP）抑制效果次之，去铁胺（DFO）对细菌生长无明显影响。台盼蓝染色和刃天青检测进一步验证了 β- 崖柏素的杀菌作用。
2. 铁剥夺对细胞的影响：β- 崖柏素处理使细菌细胞膜通透性增加，NPN 荧光强度增强，但高浓度会导致细胞裂解。同时，随着 β- 崖柏素浓度增加，细菌细胞内 ROS 水平降低，表明细胞活力丧失主要是由于细胞膜结构不稳定，而非细胞内氧化应激。
3. 对生物膜和持留菌的影响：增加 β- 崖柏素浓度会导致生物膜逐渐减少，在 24 和 48 h 时，100 和 200 μM 的 β- 崖柏素对生物膜形成有显著抑制作用。β- 崖柏素还能有效抑制持留菌形成，在致死浓度下，6 和 12 h 时持留菌数量明显减少。扫描电子显微镜观察发现，200 μM β- 崖柏素处理后，细菌细胞结构受损，出现细胞聚集和物质泄漏。
4. 铁补充的影响：补充铁（Fe²⁺）能恢复被 β- 崖柏素抑制的细菌生长，但过高浓度的 Fe²⁺（100 μM）会因铁毒性导致细菌细胞内 ROS 过度产生，进而影响细菌存活。
5. 基因表达变化：在 β- 崖柏素处理下，除 Bfd 基因表达增加外，多数铁调节基因表达降低。补充非毒性浓度的 FeSO₄后，除血红素加氧酶（hemeO）外，其他铁调节基因表达上调，这表明鲍曼不动杆菌会根据铁含量调整基因表达以维持生存。
6. 与抗生素的协同作用：在对耐粘菌素的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）研究中，β- 崖柏素与粘菌素或氯霉素联用，在较低药物浓度下就能显著抑制细菌生长，展现出协同抗菌效果。且 β- 崖柏素对哺乳动物细胞系 C2C12 无明显细胞毒性。

讨论

鲍曼不动杆菌在现代医疗系统中威胁巨大，耐药机制多样，包括产生多种 β- 内酰胺酶、修饰抗生素的酶、多药耐药外排泵等，且耐药因子可通过水平基因转移传播，现有抗生素研发滞后，急需新的防控策略。

利用铁代谢调控抗菌是一种有前景的方法。铁对细菌生理功能至关重要，铁螯合剂可干扰细菌铁摄取，破坏生物膜形成，抑制持留菌产生。β- 崖柏素与抗生素联用，能通过破坏细胞膜稳定性，增强抗生素渗透，克服鲍曼不动杆菌的耐药性，为治疗耐药菌感染提供了潜在的联合治疗方案。未来可进一步研究铁螯合剂抑制持留菌的具体机制，探索更多联合治疗组合，推动抗菌治疗的发展。