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本文聚焦寨卡病毒（SFTSV），通过分析其准种特征，发现特定氨基酸变异影响病毒特性。如 Gn（Y328H）、Gc（R624W）和 L（N1891K）突变，改变病毒斑块大小、细胞融合活性等。这为理解病毒致病机制和传播策略提供重要依据，值得关注。
### 寨卡病毒准种的研究背景
寨卡病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV）属于布尼亚病毒科白蛉病毒属，是引发寨卡病毒病（Severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS）的病原体。该疾病在东亚国家广泛分布，日本患者死亡率高达 30%，对公共卫生构成严重威胁。
SFTSV 基因组由 S、M、L 三个负链 RNA 片段组成。S 片段编码核衣壳蛋白和非结构蛋白；M 片段编码包膜糖蛋白 Gn 和 Gc；L 片段编码 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRp）。病毒通过 Gn 和 Gc 与宿主细胞表面受体结合，经受体介导的内吞作用进入细胞，随后在酸性条件下，病毒糖蛋白与内体膜融合，引发细胞融合。感染 SFTSV 的细胞可能出现细胞病变效应（Cytopathic effect，CPE），但病毒感染与细胞死亡的关系尚不明确。
此前研究从日本山口县首例 SFTSV 患者分离出 YG1 株，并建立了 E3、A4、B7 三个亚克隆。其中，A4 和 B7 在糖蛋白 Gn（Y328H）和 Gc（R624W）上存在氨基酸突变，B7 的 L 蛋白还存在 N1891K 突变，且 B7 表现出较强的 CPE。不过，这些突变在病毒学特征和种群结构中的作用尚不清楚。
研究材料与方法
- 细胞和病毒：使用 Vero E6、BSR - T7/5、Huh7、293T 等细胞系，以及 SFTSV YG1 株的亚克隆 A4、E3、B7 作为对照。所有细胞在含相应成分的培养基中，于 5% CO2、37°C 培养箱中培养，病毒感染实验在生物安全三级（BSL - 3）实验室进行。
- 质粒构建：将 YG1 株的 S、M、L 片段克隆到 TVT7R（0,0）载体，构建 pTVT7_YG1_S、pTVT7_YG1_M、pTVT7_YG1_L 质粒。通过定点突变或 In - Fusion HD 克隆试剂盒，在相应质粒中引入 Y328H、R624W、N1891K 突变。
- 重组病毒的产生：将表达病毒基因组片段的质粒与辅助质粒共转染 BSR - T7/5 细胞，收获上清作为 P1。P1 接种 Vero E6 细胞，收获 P2，再次接种 Vero E6 细胞获得 P3 作为种子病毒。通过实时 PCR、间接免疫荧光抗体试验、测序等方法确认重组病毒的产生和基因组序列。
- 病毒学检测方法：采用噬斑实验和病毒滴定评估病毒的噬斑形成能力和滴度；通过细胞融合实验观察病毒在低 pH 条件下的细胞融合活性；利用假型病毒实验检测病毒进入细胞的效率；用泛半胱天冬酶抑制剂 Z - VAD - FMK 处理感染细胞，研究细胞死亡机制；进行蛋白质免疫印迹分析检测相关蛋白表达；通过感染放线菌素 D 处理的细胞，观察野生型病毒对细胞死亡的抑制作用；开展共感染实验，比较野生型和重组病毒的竞争优势。
研究结果
- 重组病毒的建立：成功构建了 8 种携带不同突变的重组病毒，除 rGn/Gc/L 外，其他重组病毒滴度均高于 106 PFU/mL。经测序确认病毒基因组序列，为后续实验提供可靠材料。
- 噬斑形成和病毒滴度：不同重组病毒的噬斑形态各异。rGn 的噬斑大且清晰，rGc 的噬斑粗糙，Gn 和 Gc 突变可增大噬斑，rL 的噬斑小且细胞死亡，rYG1 的噬斑类似 rL 但难以看清。这表明突变影响病毒在细胞间的传播模式。
- 细胞融合活性和 CPE 评估：rGc 在低 pH 条件下有强细胞融合活性，rGn 活性较弱，二者在中性条件下无明显 CPE。rL 在低 pH 和中性条件下均有强烈 CPE，但无细胞融合。双突变病毒 rGn/L 和 rGc/L 在低 pH 下有细胞融合和强烈 CPE，说明不同突变对病毒感染细胞的过程影响不同。
- 氨基酸改变对病毒进入细胞的影响：假型病毒实验显示，Gn 的 Y328H 突变抑制病毒进入细胞，而 Gc 的 R624W 突变可抵消这一劣势，表明病毒在适应细胞过程中，不同突变间可能存在相互作用。
- 与 SFTSV 感染相关的程序性细胞死亡：泛半胱天冬酶抑制剂 Z - VAD - FMK 可抑制 rGn/Gc/L 和 rL 感染诱导的细胞死亡，说明其细胞死亡机制依赖半胱天冬酶。rL 和 rYG1 感染细胞均诱导 caspase 1 和 3 表达，表明感染可触发程序性细胞死亡。
- 野生型 SFTSV 对放线菌素 D 诱导细胞死亡的抑制作用：rYG1 感染可抑制放线菌素 D 诱导的细胞死亡，且在不同细胞系中均有此现象，说明野生型病毒可能具有抵抗宿主细胞死亡的机制。
- 野生型和重组病毒在病毒传播中的竞争：共感染实验表明，无论重组病毒接种剂量如何，rYG1 在共培养后均占主导地位，且未观察到 CPE，显示野生型病毒在 Vero E6 细胞中的复制优势。
研究讨论
- 病毒准种特征与传播适应：患者血液中约 30% 的病毒存在 Gn 的 Y328H 变异，病毒分离后该变异比例下降。重组病毒实验表明，Gn 的 Y328H 突变虽不利于病毒进入 Vero E6 细胞，但可能对体内未知靶细胞有利。同时，Gc 的 R624W 突变可增强病毒融合活性，但单独存在时不利于病毒在 Vero E6 细胞生长，二者共同作用可能促进亚克隆在细胞中的传播。
- 细胞死亡机制与病毒生存策略：L 蛋白的 N1891K 突变在 CPE 诱导中起重要作用，但具体机制不明。泛半胱天冬酶抑制剂可抑制相关细胞死亡，暗示存在 caspase 依赖机制，但未证实是否诱导细胞凋亡。野生型病毒可抑制细胞死亡，而携带 N1891K 突变的病毒则不能，表明 SFTSV 可能存在避免细胞死亡的机制，以利于病毒在细胞内生存。
- 研究的局限性与展望：本研究虽取得一定成果，但存在局限性。如利用小基因组报告系统评估聚合酶活性时，在实际感染细胞中检测灵敏度不足。未来需探索更有效的方法评估病毒聚合酶活性，深入研究病毒感染机制，为防控 SFTS 提供理论依据。
本研究通过分析 SFTSV 准种，揭示了特定氨基酸变异对病毒特性的影响，为理解病毒致病机制和传播策略提供了重要线索，对防控该疾病具有重要意义。
