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这篇研究利用 TCGA 和 GEO 数据库，分析胃癌（GC）相关数据。通过非负矩阵分解聚类，将患者分为 C1 和 C2 两种免疫预后亚型，发现二者在免疫特征、治疗反应等方面存在差异。肿瘤内微生物组与免疫浸润及免疫基因相互作用影响 GC 预后，Candidatus Nitrosotenuis有重要预后价值。
### 研究背景
胃癌（GC）是全球常见的恶性肿瘤，预后较差，发病率在东亚、东欧等地较高。肿瘤微环境（TME）中的微生物组对肿瘤发生有影响，
Helicobacter pylori等肿瘤内微生物组参与 GC 发病机制并影响治疗效果。目前细菌 - 免疫基因在 GC 中的作用尚不清楚，本研究旨在剖析 GC 中的免疫基因，探究预后差异、免疫表型及免疫治疗反应，为 GC 治疗提供新策略。
材料与方法
- 数据获取：从癌症基因组图谱（TCGA）数据库获取胃腺癌（STAD）患者的 mRNA 表达数据，从 NCBI 基因表达综合数据库（GEO）下载相关数据集，还从 GeneCards 数据库和人类微小 RNA 疾病数据库获取基因和 miRNA 数据。
- 免疫亚型分类：以免疫相关基因作为候选基因集，用 Cox 回归分析评估其与总生存期（OS）的相关性，通过非负矩阵分解（NMF）聚类方法进行分类，并在外部验证集验证。
- 免疫细胞浸润分析：运用多种算法评估免疫细胞和基质细胞的浸润情况，如微环境细胞群体（MCP）算法、单样本基因集富集分析（ssGSEA）和 ESTIMATE 算法。
- 亚型基因集富集分析（GSEA）：利用 limma 和 clusterProfiler R 包对基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路进行 GSEA 分析。
- 免疫亚型性能验证：分析 GC 亚型间的差异表达基因（DEGs），构建 60 - 基因分类器，用最近模板预测（NTP）算法预测亚型并与 NMF 算法结果对比。
- 免疫治疗和药物敏感性分析：通过 SubMap 分析预测免疫治疗疗效，用 pRRophetic R 包基于癌症药物敏感性基因组学（GDSC）数据库评估化疗敏感性。
- 免疫亚型间肿瘤内微生物组差异分析：用 Kraken 分析研究肿瘤内微生物组，通过多种微生物组相关分析预测和验证免疫亚型。
- 重要基因调控网络分析：用 “RcisTarget” 包预测转录因子，构建 mRNA - miRNA 相互作用网络，分析关键基因与肿瘤内微生物的相关性。
- 实验验证：进行多重免疫组织化学（mIHC）、细胞培养与转染、构建预后模型、荧光原位杂交（FISH）和动物实验，并运用 R 语言进行统计分析。
研究结果
- 预后相关基因和分子亚型的鉴定：通过 Cox 单因素回归筛选出 57 个预后相关基因，NMF 聚类确定最佳聚类数为 2，分为 C1 和 C2 两种分子亚型。C2 亚型患者生存可能性更高，在多个数据集中均得到验证。
- 亚型免疫特征分析：C2 亚型在 Th2 和 Th17 细胞等免疫特征方面表现更优，细胞周期和 MYC 通路激活相关评分更高，免疫和基质评分低于 C1 亚型。
- 免疫水平评估：MCP 和 ssGSEA 算法分析显示，两种亚型免疫浸润水平差异显著。C2 亚型 Th2 和 Th17 细胞更多，C1 亚型 PDCD1LG2 和 TLR9 表达增加。GO 和 KEGG 分析表明，两种亚型在多个相关通路存在明显差异。
- 分子亚型的药物敏感性和突变负荷水平验证：构建的 60 - 基因分类器可有效区分亚型。不同亚型对多种化疗药物敏感性不同，C2 亚型在多个基因的突变比例更高，在微卫星不稳定性（MSI）、新抗原和肿瘤突变负荷（TMB）方面与 C1 亚型存在显著差异，C1 亚型对免疫治疗更敏感。
- 分子亚型的免疫相关基因验证：多种免疫相关基因在不同免疫亚型中的表达存在显著差异，C1 和 C2 亚型分别有特定免疫相关基因高表达。
- 分子亚型间的 TIDE 分析：肿瘤免疫功能障碍和排除（TIDE）分析显示，两种亚型在功能障碍、排除、无获益和应答者等方面存在显著差异。
- 亚型间肿瘤内微生物组分布：微生物丰度与免疫浸润水平存在相关性，不同免疫亚型中免疫相关基因、细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）基因与微生物存在关联。免疫治疗应答和非应答组中，免疫细胞浸润水平与微生物丰度的相关性不同，巨噬细胞 M2 的浸润水平在两组间差异显著。
- 亚型间差异表达分析：分析得到 1860 个差异表达基因，随机生存森林分析确定 CXCR4、TRIM31、GPR35 和 LMNB2 为关键基因，其表达与患者生存情况相关。
- 关键基因的调控网络分析：关键基因受多种转录因子调控，预测出相关 miRNA 并构建了 mRNA - miRNA 相互作用网络。关键基因与多种微生物存在显著相关性，部分微生物在 C1 和 C2 亚型中的丰度存在差异。
- 关键基因免疫意义的检验和验证：关键基因与多种免疫细胞存在显著关联，mIHC 验证了部分关键基因与 T 细胞标记物的相关性。小鼠皮下肿瘤模型实验表明，过表达关键基因会影响肿瘤增殖，且与免疫逃避有关。
- 预测模型的预后相关构建和关键肿瘤内微生物群的探索：通过 LASSO 回归构建预后模型，高风险组患者总生存期较低风险组短，模型有一定预测准确性。Candidatus Nitrosotenuis对 GC 患者预后有显著预测价值。
讨论
本研究鉴定出两种 GC 免疫亚型 C1 和 C2，C2 亚型生存预后更好。C1 亚型免疫和基质评分较高，免疫治疗敏感性可能更高；C2 亚型基因突变更多，化疗敏感性更好，可能有更优的预后。C2 亚型在与蛋白质合成、能量代谢等相关的通路评分更高，有助于维持代谢稳定和预防癌症进展。肿瘤内微生物组与免疫细胞和基因相互作用，影响 GC 进展，Candidatus Nitrosotenuis可作为预后预测指标，关键基因与微生物存在复杂相互作用。本研究为 GC 分子分型和个性化治疗提供了新视角，但存在一定局限性，如受分析方法和数据集来源限制，未充分验证预测模型，未深入探讨外部因素对 TME 的影响等，未来需进一步研究。
