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胆管癌（CCA）预后差，传统诊断方法有局限，液体活检中胆汁样本作用大但缺乏标准化流程。研究人员开展胆汁样本蛋白质和 ctDNA 室温稳定性研究，发现样本 7 小时内稳定。这为胆汁样本处理提供依据，助力 CCA 分子诊断123。
在癌症研究领域，胆管癌（Cholangiocarcinoma，CCA）犹如一颗 “恶性炸弹”，严重威胁着人类健康。它是一种侵袭性很强的胆管恶性肿瘤，预后情况不容乐观，患者往往面临着有限的治疗选择。目前，早期发现和精准的分子特征描述对于改善胆管癌患者的临床结局至关重要。然而，传统的诊断方法，比如组织活检，不仅具有侵入性，还常常难以捕捉到肿瘤的分子异质性，就像用一把 “大刷子” 去描绘一幅精细的画作，总是遗漏许多关键细节。因此，医学界迫切需要一种更微创、更全面的诊断方法，这就为液体活检的发展提供了契机。
液体活检作为一种新兴的技术，在多种癌症的分子分析中展现出了巨大的潜力，在胆管癌的诊断中也不例外。胆汁，这个直接与肿瘤细胞 “亲密接触” 的液体，富含肿瘤衍生的成分，如蛋白质、RNA 以及循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），这些都可以作为疾病检测和监测的生物标志物，堪称癌症诊断的 “宝藏库”。但是，由于缺乏标准化的胆汁样本制备方案，使得胆汁在液体活检中的应用受到了很大限制。不同的存储条件、处理方法以及存储时间，都会对胆汁衍生的生物标志物的稳定性产生显著影响，进而影响分子检测的可靠性，就像搭建一座不稳定的桥梁，难以支撑精准诊断的 “重任”。
为了解决这些问题，来自韩国庆熙大学东三医学中心（Keimyung University Dongsan Medical Center）的研究人员挺身而出，开展了一项极具意义的研究。他们的研究聚焦于胆汁样本中蛋白质和 ctDNA 在室温条件下的时间稳定性，目的是优化分子诊断的分析前处理流程。
研究人员为了开展这项研究，采用了多种关键技术方法。首先，他们从 6 名被诊断为肝外胆管癌的患者身上收集胆汁样本（样本队列来源），并将样本分为 4 份，在收集后的 1、3、5、7 小时分别进行处理。在处理过程中，使用了离心技术获取上清液和沉淀。然后，通过 NucleoSpin? cfDNA XS Kit 试剂盒提取胆汁样本中的 ctDNA，并利用数字 PCR（Droplet digital PCR，ddPCR）技术检测突变的 KRAS ctDNA 水平。对于蛋白质的分析，运用 Bradford 法测定蛋白质浓度，采用酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测 E - 钙黏蛋白（E-Cadherin）和 N - 钙黏蛋白（N-Cadherin）的酶活性。同时，利用 R 软件和 Sigma plot 软件进行统计分析。
研究结果如下：
- 胆汁样本制备：详细说明了胆汁样本的制备过程，确保样本处理的规范性。
- 蛋白质浓度：通过 Bradford 法对 6 名患者胆汁中的蛋白质浓度进行分析，发现 7 小时内蛋白质浓度虽有微小波动，但无显著变化（重复测量方差分析；P=0.828，η2=0.007）。这表明胆汁中的蛋白质在室温下 7 小时内保持稳定，不会出现明显的降解，为后续基于蛋白质的分析提供了可靠的基础。
- ctDNA 浓度：对 6 名患者胆汁中的突变 KRAS DNA 浓度进行评估，其中 4 名患者的 KRAS 为野生型，2 名患者存在 KRAS 突变。在 7 小时内，无论是野生型还是突变型 KRAS 组，ctDNA 浓度均无显著变化（重复测量方差分析；P=0.926，η2=0.059 和 P=0.399，η2=0.059）。这说明胆汁来源的 ctDNA 在室温下 7 小时内也保持稳定，为分子分析和生物标志物评估提供了稳定的检测指标。
- E - 和 N - 钙黏蛋白酶活性：对 1 名患者胆汁中的 E-Cadherin 和 N-Cadherin 酶活性进行检测，7 小时内两种酶活性均无显著变化（P=0.650）。这意味着胆汁在收集后的 7 小时内，相关代谢未发生显著改变，也进一步支持了胆汁样本在短期内用于生物标志物分析的可行性。
在研究结论和讨论部分，研究人员发现胆汁样本中的蛋白质、ctDNA 以及上皮 - 间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）标记物的活性在 7 小时内均无显著变化。这一结果意义重大，它表明胆汁可以作为一种可靠的样本来源用于分子诊断，即使在现实临床环境中无法立即处理样本，也不用担心样本中的生物标志物会迅速降解。这为样本的收集和运输带来了极大的便利，比如在一些医疗资源相对匮乏、无法及时进行样本处理的地区，也能够保证胆汁样本检测的可靠性。同时，该研究也验证了胆汁在临床和研究环境中用于蛋白质检测的实用性，为胆管癌的发病机制研究和预后判断提供了有力支持。
然而，这项研究也存在一些局限性。样本量较小（n=6），且缺乏在更大规模、多中心队列中的验证。对于 EMT 标记物的分析仅在 1 名患者的胆汁中进行，这可能会受到个体差异的影响，限制了研究结果的普遍性。此外，研究缺乏对照组，这也可能对研究结果的全面性产生一定影响。
尽管存在这些不足，但该研究依然为胆管癌的液体活检开辟了新的道路。它为制定胆汁样本处理和存储的标准化方案奠定了基础，有助于推动胆汁基液体活检技术在临床实践中的广泛应用。未来，还需要进一步开展大规模的研究，深入探讨不同存储条件对胆汁样本的影响，全面评估患者个体因素对胆汁成分和生物标志物稳定性的作用，从而不断完善胆汁在精准肿瘤学中的应用，为胆管癌患者带来更多的希望。
