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本文开发并验证了一种基于 PCR 技术检测土壤中Phytophthora agathidicida卵孢子的方法。通过优化卵孢子分离、裂解和 DNA 提取技术，设计特异性引物，该方法检测灵敏度高、速度快，能有效提高P. agathidicida检测效率，助力森林病害防控。
### 研究背景
Phytophthora属物种是全球极具破坏力的植物病原体，能引发作物、森林和自然生态系统的严重枯萎和根腐病。
Phytophthora agathidicida是导致新西兰贝壳杉（
Agathis australis）枯萎病的病原菌，这种病菌通过根部感染贝壳杉，造成树干出血性病变、颈腐、树冠落叶，最终致使树木死亡。自 20 世纪 70 年代首次发现症状以来，它一直在新西兰贝壳杉森林中蔓延。由于其潜伏期长达 1 - 10 年，在可见症状出现前，病原菌就可能已在土壤中存在多年，因此早期准确检测对控制病害至关重要。
目前检测Phytophthora物种的常用方法是土壤诱饵法，即向淹水的土壤样本中引入易感植物材料作为诱饵，刺激潜在的Phytophthora孢子萌发和生长，再通过后续培养或分子检测方法鉴定病原菌。但该方法存在诸多局限性，如耗时、费力，容易漏检生长缓慢或挑剔的物种，对于产生休眠孢子（如卵孢子）的Phytophthora物种，还可能出现高假阴性率。基于 DNA 的检测方法，如环介导等温扩增（LAMP）、聚合酶链式反应（PCR）、元条形码技术等，虽然可直接检测土壤中的Phytophthora DNA，但面临土壤样本体积限制、卵孢子裂解效果不佳、共提取 PCR 抑制剂等问题，且与诱饵法相比，检测效果不稳定。因此，开发更可靠、高效的检测Phytophthora物种的技术迫在眉睫。
材料和方法
- 靶序列鉴定与引物设计：利用 Geneious 2023.0.4 的 Repeat Finder 插件，在P. agathidicida分离株 3770 的基因组序列（GenBank Assembly: GCA_025722995.1）中寻找潜在的重复序列，发现一个约 8636 bp 的序列，预测编码 Copia 家族的长末端重复（LTR）反转录转座子，其 LTR 区域在P. agathidicida中高度特异。通过比较基因组学、BLAST 搜索等方法评估其特异性，并利用 reads 映射估计该区域与之前常用靶区域（ITS 和cob）的拷贝数。最终使用 Primer3 v4.1.0 在 LTR 区域设计出引物对 PA - LTR - for（5? - ACGCGCTCTGTTTCTTTAGC - 3?）和 PA - LTR - rev（5? - GCGGGCTTCCATTCAATTCA - 3?）。
- 引物特异性和灵敏度的体外测试：提取P. agathidicida的 3 个分离株（NZFS 3770、3772 和 3813）以及 8 种其他Phytophthora物种的基因组 DNA，以 1 ng 基因组 DNA 为模板，用 PA - LTR 引物对进行终点 PCR 检测引物特异性，同时与之前报道的 PTA_ITS 引物对进行比较。用P. agathidicida NZFS 3770 基因组 DNA 的 10 倍系列稀释液（100 pg 到 0.001 pg）评估 PA - LTR 和 ITS 引物的灵敏度，PCR 产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳分析。
- 土壤样本检测方法优化：选取 10 个已知P. agathidicida（PA）状态的土壤样本，用 3 种不同方法提取 DNA：一是按 DNeasy PowerSoil Pro 试剂盒说明书提取 250 mg 土壤；二是使用该试剂盒，但用 SK38 土壤研磨珠（2 mL；Precellys）代替试剂盒提供的 PowerBead Pro 管；三是用双滤袋法将约 12.5 g 土壤处理至约 250 mg 后，再用试剂盒和 SK38 土壤研磨珠提取。提取的 DNA 用 PA - LTR 引物进行终点 PCR，通过向第二个 PCR 反应中加入基因组 DNA 来检测潜在抑制作用。
- 卵孢子裂解方法和 DNA 提取效率比较：培养P. agathidicida（NZFS 3770）菌丝体 6 - 8 周，经匀浆、过滤获得纯化卵孢子，用血细胞计数板或 Scepter 3.0 手持式自动细胞计数器估计卵孢子浓度。取约 280,000 个卵孢子，分别用 PowerBead Pro 管或 SK38 土壤研磨珠（2 mL；Bertin Corp）进行 10 min 涡旋裂解，在光学显微镜下观察裂解效果。
- 土壤中卵孢子的分离方法：开发双滤袋法分离土壤中的卵孢子。用 90 μm 尼龙膜制成 6 × 6 cm 的小袋，装入约 2/3 体积的土壤（平均样本重量 12.5 g ± 3 g SD），密封后放入 7.5 × 8 cm、25 μm 尼龙膜制成的外袋中。将双滤袋浸入 50 mL 蒸馏水中，涡旋、浸泡，更换蒸馏水后再次浸泡，取出外袋，冲洗、离心，所得沉淀用于后续 DNA 提取、PCR 或 qPCR 检测。
- 田间样本综合检测评估：对 65 个经混合诱饵 - LAMP 检测的田间土壤样本，用优化后的方法（双袋过滤卵孢子，SK38 珠管提取 DNA）进行处理。提取的 DNA 样本进行 3 种检测：一是用 PA - LTR 引物进行标准终点 PCR，设置 1 或 3 μL 样本 DNA 输入量，并添加 PCR 增强剂混合物 P（PEC - P），同时进行抑制检测；二是用针对Phytophthora（ITS6 和 5.8 S - 1R）和 Clade 5（PTA_ITS_F2 和 PTA_ITS_R3）设计的引物进行终点巢式 PCR；三是设计 TaqMan 探针 PA - LTR - TaqMan probe，用 QuantStudio3 实时 PCR 系统进行定量 PCR（qPCR），构建标准曲线计算土壤样本中P. agathidicida DNA 浓度。
结果
- 引物设计与计算机验证：生物信息学分析发现P. agathidicida基因组中一个高度重复的转座子序列，属于 LTR/Copia 转座子家族，其 LTR 区域在其他Phytophthora基因组中无匹配 reads。BLAST 分析表明该区域对P. agathidicida高度特异，与之前研究的靶区域相比，LTR 区域拷贝数更高，其读深度是基因组平均深度的 470 倍，而 ITS 序列和线粒体cob序列的拷贝数分别为 217 和 105。
- 引物特异性和灵敏度的体外测试结果：PA - LTR 引物能成功扩增所有测试的P. agathidicida分离株的目标产物，而对其他Phytophthora物种无扩增，特异性优于 PTA_ITS 引物。PA - LTR 引物灵敏度高，能检测到 0.001 pg 的P. agathidicida基因组 DNA，检测限比 ITS 引物低 10 倍。在高浓度 DNA 样本中，还观察到一个 98/103 bp 的次要产物，这是由基因组 6 号染色体缺失导致的。
- 卵孢子裂解和 DNA 提取优化结果：使用 PowerBead Pro 管裂解卵孢子效果不佳，多数卵孢子保持完整；而 SK38 土壤研磨珠能实现几乎完全裂解。用 SK38 珠管重新检测 10 个土壤样本，P. agathidicida的检测率从 33% 提高到 50%，但仍低于混合诱饵 - LAMP 检测率。
- 综合检测方法的效果：双滤袋法结合优化的 DNA 提取和 PA - LTR 引物终点 PCR，对 10 个已知 PA 状态的土壤样本检测率达到 100%，无假阳性或假阴性结果。对 65 个田间样本检测发现，优化方法的阳性检测率为 69%（45/65），远高于混合诱饵 - LAMP 检测率（11%，7/65）。巢式 PCR 验证结果显示，45 个终点 PCR 阳性样本中有 38 个也呈阳性，20 个终点 PCR 阴性样本巢式 PCR 也为阴性。qPCR 结果表明，不同检测方法分类的样本中P. agathidicida DNA 含量存在差异，且与贝壳杉树的症状状态相关，有明显症状的树土壤中 DNA 含量最高。
讨论
本研究开发并验证了一种新颖的 DNA 提取和 PCR 检测方法，用于可靠检测土壤样本中的P. agathidicida。该方法先通过双滤袋法基于大小分离卵孢子，再用优化的 DNA 提取方案（含 SK38 土壤研磨珠），最后用针对P. agathidicida基因组高度重复区域设计的引物进行终点 PCR 检测。
双滤袋法有效解决了直接土壤检测的诸多问题，如病原体滴度低、土壤异质性和样本体积限制等。与其他分离方法相比，它更快速、简便，交叉污染风险低，还可通过调整滤袋孔径和大小，应用于分离其他病原体或生物。卵孢子裂解是成功提取 DNA 的关键，SK38 土壤研磨珠显著提高了细胞裂解效率和 DNA 提取效果。
本研究开发的终点 PCR 检测方法比现有检测P. agathidicida的方法具有明显优势，特异性更高，能检测到更低含量的 DNA，且结合优化提取方法后，检测率大幅提高。与目前批准的基于土壤诱饵的检测方法相比，本方法无需诱饵和培养，可在现场检测，减少了对专业实验室和 containment 设施的依赖，使用便携式设备即可完成，检测速度快、成本效益高，有助于当地社区开展监测工作，更好地保护贝壳杉森林健康。
