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新冠疫情期间，中和抗体水平对预测免疫反应至关重要。本文通过研究不同免疫史个体血清，发现相同抗受体结合域（RBD）免疫球蛋白水平的血清，中和效力却不同。这表明解读抗 RBD 酶联免疫吸附试验（ELISA）数据时需谨慎，应考虑免疫背景，对未来相关研究意义重大。
### 研究背景
2020 年 3 月 11 日，SARS-CoV-2 疫情正式宣告爆发。截至 2024 年 4 月 4 日，世界卫生组织报告了大量的 COVID-19 病例和死亡人数。评估针对 SARS-CoV-2 的免疫状态，对于制定和调整有效的疫苗接种策略、优化公共卫生应对措施至关重要。
在众多评估指标中，中和抗体由于其与预防疾病的直接关联，常被用作保护相关性指标。SARS-CoV-2 病毒刺突蛋白的受体结合域（RBD），在病毒附着宿主细胞过程中发挥关键作用，大量中和抗体都靶向该区域。基于此，通过检测抗 RBD 结合抗体水平，来评估血清中和能力的方法备受关注。与活病毒中和试验相比，抗体结合试验操作更简便、对生物安全等级要求更低，且能高通量检测，因此在疫情期间常被用作替代检测方法。
不过，以往多数研究集中在同源群体，如康复个体或接种特定疫苗的人群。但有研究表明，接种疫苗的个体中存在较高比例的非中和抗体，且这些非中和抗体也可能靶向病毒的 RBD 区域。此外，还有针对刺突蛋白其他区域的中和抗体，无法被抗 RBD 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测到。因此，本研究提出假设：具有相同抗 RBD 单位的血清，其中和效力可能存在差异。并对混合免疫（COVID-19 康复后接种疫苗）和全程接种疫苗的异质队列进行了研究。
材料和方法
研究选取了 27 份来自 SARS-CoV-2 康复且接种疫苗个体的血清（其中 13 份接种 ChAdOx1-S [阿斯利康] 疫苗，13 份接种 BNT162b2 [辉瑞] 疫苗，1 份接种 mRNA-1273 [莫德纳] 疫苗），以及 27 份仅接种疫苗个体的血清（CoVVac 队列 [NCT04858607]，接种两剂 mRNA-1273 [莫德纳] 疫苗）。康复个体的感染情况，在 2020 年 3 月至 12 月期间通过病毒 RT-PCR 确诊，且均在 SARS-CoV-2 Alpha（B.1.1.7）和 Beta（B.1.351）变异株出现之前。本研究遵循赫尔辛基宣言的指导原则，并获得了格拉茨医科大学伦理审查委员会的批准。
实验前，所有血清样本都在 56°C 加热灭活 30 分钟。使用 Elecsys anti-SARS-CoV-2 S ELISA（ACOV2S，罗氏诊断），按照制造商的方案测定抗 RBD 结合单位，相关数据此前已分别在 Sourij 等人（仅接种疫苗组）和 Niedrist 等人（混合免疫组）的研究中发表。
采用基于组织培养半数感染剂量（TCID50）的中和试验，检测血清的中和能力。具体操作是将血清样本进行 2 倍系列稀释（1:5 - 1:10,240），与从德国一例从中国返回后确诊的临床病例中获得的 SARS-CoV-2 分离株 BetaCoV/Munich/BavPat1/2020 混合，以免疫球蛋白耗尽的血清作为对照。孵育 1 小时后，将病毒 - 血清混合物接种到含有 Vero E6 细胞的 96 孔板中，感染复数为 0.0025 。48 小时后，在光学显微镜下评估细胞病变效应，中和滴度（NT50）反映了能使 50% 的孔免受病毒诱导的细胞病变效应的最高血清稀释度。
病毒的增殖也按照先前描述的方法进行。使用 Vero E6 细胞进行病毒感染，感染 72 小时后收获上清液，经 0.2μm 过滤澄清后，冻存于 - 80°C 备用。采用常规免疫斑块试验对病毒进行定量，通过一系列细胞处理和抗体孵育步骤，最终在显微镜下分析斑块数量。
所有涉及病毒分离株的操作，均在格拉茨医科大学卫生、微生物和环境医学诊断与研究所的二级生物安全柜中，在 BSL-3 条件下进行。统计分析使用 Mann-Whitney U 检验，以 P < 0.05 为具有统计学意义，使用 GraphPad Prism（9 版）进行分析和绘图，使用 IBM SPSS Statistics 29.0.0.0 进行事后功效分析。
结果
研究旨在评估不同免疫方案下，具有相似抗 RBD 结合抗体量的血清，其中和抗体比例是否相同。对所有血清样本进行抗 RBD 总 Ig 结合单位检测，并根据检测结果将混合免疫血清与仅接种疫苗血清进行匹配。使用原始 SARS-CoV-2 毒株进行活病毒中和试验。
结果显示，抗 RBD 单位与混合免疫组（r = 0.6419）和仅接种疫苗组（r = 0.6586）的病毒中和能力均相关。但当两组合并分析时，这种相关性减弱（r = 0.5601）。实际上，仅接种疫苗组的血清中和效力显著降低（NT: 抗 RBD 单位）。这表明，具有相同抗 RBD 单位的血清，其中和效力存在显著差异。
讨论
确定针对传染病（如 SARS-CoV-2）的免疫状态，对公共卫生意义重大，有助于评估人群疫苗接种覆盖率、评价疫苗接种活动的效果、识别疫苗接种覆盖率较低的人群，并采取针对性措施加强保护，特别是对弱势群体。此外，监测免疫状态还有助于疫情监测、卫生资源规划和制定循证干预措施，以减少疾病在人群中的传播。
虽然活病毒中和试验是评估血清病毒中和活性的金标准，但由于其需要 BSL-3 设施、资源消耗大且操作复杂，不适合快速大规模筛查。因此，血清学高通量方法（如 ELISA 和化学发光免疫分析）在常规诊断中更受青睐。此前研究表明，ELISA 检测的抗 RBD 总 Ig 结合单位与活病毒中和试验检测的中和抗体之间存在强相关性，这意味着检测抗 RBD 结合单位可作为量化中和能力的替代指标。
然而，近期证据表明，非中和抗体也可靶向病毒的 RBD 区域。本研究发现，虽然抗 RBD 结合单位与所有测试组的 SARS-CoV-2 中和显著相关，但具有相同抗 RBD 单位的血清，其中和滴度（NT50）存在差异。例如，抗 RBD 单位在 2,500 - 5,000 U/ml 的组中，NT50在 640 - 5,120 之间变化。这种差异与免疫方案有关，混合免疫组的中和效力（病毒中和：抗 RBD 单位）高于仅接种疫苗组，这可能是因为仅接种疫苗组中存在较高比例的非中和抗体，这与 Amanat 等人的研究结果一致。
本研究存在一定局限性，混合免疫组和仅接种疫苗组的疫苗接种方案存在差异，不能完全排除混合免疫组较高的效力指数是由不同免疫方案导致的，这需要在未来研究中进一步评估。此外，样本量也存在局限性。但研究结果仍具有重要意义，在未来可能的 SARS-CoV-2 疫情爆发中，RBD 滴度水平不一定能反映血清抗体中和能力的质量，在不考虑免疫史的情况下，不能直接将其视为可靠的保护相关性指标。
由于 SARS-CoV-2 持续进化，携带 RBD 突变的变异株不断出现，这些突变可能改变抗体结合和中和能力，使抗 RBD 结合试验预测中和能力变得更加复杂。因此，在解释抗 RBD ELISA 结果时应谨慎，并根据 SARS-CoV-2 不断变化的抗原格局，调整和重新评估血清学检测方法。
结论
SARS-CoV-2 疫情凸显了在疫情爆发期间，常规使用的血清学检测方法，需准确反映个体保护水平的重要性。虽然抗 RBD 抗体通常能中和病毒，且与中和作用密切相关，但本研究再次强调，针对 RBD 特异性抗体的检测方法，不一定能预测特定的中和滴度。在解释不同队列的血清学检测结果，以及预测保护性免疫时，考虑免疫背景至关重要。
