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本文研究了超氧化物歧化酶 C（sodC）基因用于检测咽拭子中脑膜炎奈瑟菌（N. meningitidis）携带情况的效用。通过对青少年咽拭子样本检测，发现 sodC 检测虽敏感性高，但特异性不足，易出现假阳性，在流行病学研究中需谨慎解读结果。
### 研究背景
脑膜炎奈瑟菌（
Neisseria meningitidis）是一种革兰氏阴性双球菌，可引发危及生命的侵袭性脑膜炎球菌病（IMD）。全球每年约有 120 万病例和 13.5 万人死亡。该菌主要寄居于无症状携带者的口咽黏膜，通过气溶胶飞沫或直接接触分泌物传播。青少年时期，由于社交接触频繁且密切，感染风险增加，携带率急剧上升，在 19 岁左右达到峰值。
实时荧光定量 PCR（RT-PCR）常用于检测无症状携带和 IMD。PCR 检测中最常用的靶基因是荚膜转运 A（ctrA）基因和孔蛋白 A（porA）基因。ctrA基因是脑膜炎奈瑟菌特有的，在无菌样本中检测到ctrA被视为 IMD 诊断的金标准。但在口咽部位，大多数携带的脑膜炎奈瑟菌是无荚膜的共生菌株，缺乏荚膜生物合成基因，因此仅针对ctrA基因的 PCR 检测对脑膜炎奈瑟菌携带研究的筛查不够敏感。
porA基因被认为是脑膜炎奈瑟菌携带筛查的另一个靶点。尽管在其他一些奈瑟菌属物种中存在高度相似的porA假基因，但通过优化引物和探针，可显著提高Neisseria meningitidis porA的特异性。与基于ctrA的检测相比，针对porA基因的 RT-PCR 能检测到无荚膜的脑膜炎球菌菌株，敏感性更高。不过，porA在淋病奈瑟菌中很少见，且在一些脑膜炎球菌中缺失，存在假阳性和假阴性风险。
超氧化物歧化酶 [Cu-Zn] 基因（sodC）也被提议作为脑膜炎奈瑟菌 RT-PCR 携带筛查的替代靶点。sodC基因对脑膜炎奈瑟菌具有高敏感性和特异性，存在于所有已知变体中，包括无荚膜菌株。然而，其他咽部微生物（如嗜血杆菌属）也含有相似的sodC基因，可能导致假阳性结果。此前多项研究使用sodC基因的效果不一。本研究旨在评估sodC RT-PCR 在检测青少年咽拭子样本中脑膜炎奈瑟菌的性能，并验证 “B-Part-of-It” 脑膜炎奈瑟菌携带研究中长期深冻（-80°C）样本的可用性。
材料和方法
在检测方法开发过程中，利用细菌培养物优化检测。使用的脑膜炎奈瑟菌菌株来自美国典型培养物保藏中心（ATCC）、澳大利亚国家奈瑟菌网络（National Neisseria Network）、英国国家典型菌种保藏中心（National Collection of Type Cultures，NCTC）和内部培养对照，包括 A、B、C、W135、Y 和 X 血清群的菌株。嗜血杆菌对照包括流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）和副流感嗜血杆菌（Haemophilus parainfluenzae）。用于比较测试的是从 “B-Part-of-It” 研究（NCT03089086）中选取的 1092 份青少年口咽拭子 DNA 提取物，这些样本于 2017 年采集后冷冻保存在 -80°C。“B-Part-of-It” 研究是一项在南澳大利亚州中学生（约 15 - 18 岁）中开展的集群随机对照试验，旨在研究 4CMenB 疫苗对青少年中与疾病相关的脑膜炎奈瑟菌携带的影响。
使用 MagNA Pure 96 Total NA Isolation 试剂盒在 MagNA Pure 96 系统上提取 DNA。sodC检测的引物和探针基于先前研究，内部设计了带有锁核酸（locked nucleic acid，LNA）的sodC探针。在计算机模拟检测开发过程中，使用 Geneious 程序构建核苷酸比对，将引物序列与不同血清群脑膜炎奈瑟菌的sodC基因以及多个嗜血杆菌属的同源基因进行比对。通过体外优化确定引物和探针浓度，并使用脑膜炎奈瑟菌实验室阳性对照验证sodC检测的有效性。
使用脑膜炎奈瑟菌 B 血清群对照菌株进行 10 倍系列稀释，进行 RT-PCR 检测，以确定该检测的检测限。在所有测试中，向优化的主混合液中添加抑制对照引物和探针。
优化检测方法后，对 “B-Part-of-It” 研究中的 1092 份鼻咽拭子样本进行检测。PCR 程序包括 50°C 预变性 15 分钟，95°C 变性 10 分钟，然后进行 45 个循环，每个循环为 95°C 10 秒、55°C 退火 15 秒、60°C 延伸 30 秒，该程序与 “B-Part-of-It” 携带研究中使用的porA检测一致，以确保结果具有可比性。
构建 2×2 列联表，将sodC检测结果与作为 “金标准” 的porA检测结果进行比较。使用 Stata 17.0 软件计算诊断指标，包括敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）。
结果
对 2017 年研究中储存的样本进行porA检测，以确定 DNA 是否有显著降解。所有重新检测的样本porA检测均为阳性，循环阈值（CT）值与 2017 年检测结果相差不超过 1 个循环，证实样本中的 DNA 几乎没有降解，且未观察到阳性孔的交叉污染。在提取板上，共有 8 个样本porA检测呈阳性。检测限测试表明，在 10?3 稀释度下，使用 LightCycler 480 进行 PCR 检测时，遗传物质不足以检测到脑膜炎奈瑟菌的存在。
PCR 检测限为 67 CFU / 反应或 536 CFU/mL。
从 Geneious 软件的序列比对结果来看，在探针结合区域内有两个碱基，其外侧还有一个 G 碱基。调整探针结合区域，使其包含这个 G 碱基，并将这三个特定核苷酸 “锁定”。LNA 探针比对结果显示，只有脑膜炎奈瑟菌菌株包含这三个碱基，其他非脑膜炎奈瑟菌菌株均未完全匹配。将该探针比对结果在基本局部比对搜索工具（BLAST）中进行搜索，结果表明除脑膜炎奈瑟菌外，该 LNA 探针与其他细菌没有完全匹配。使用 LNA 探针检测相同的一组对照菌株，除 W 血清群菌株仍为阴性外，其他所有脑膜炎奈瑟菌菌株都有很好的扩增效果。之前检测呈阳性的嗜血杆菌属菌株交叉点较高，但仍被视为检测到。
从 -80°C 储存的 DNA 提取板中检索到 1092 份 DNA 提取物。与 “B-Part-of-It” 研究的数据相比，之前 116 份porA阳性样本sodC检测也均为阳性。此外，在 2017 年原始研究中 849 份porA阴性样本sodC检测呈阳性。以porA RT-PCR 作为检测脑膜炎奈瑟菌携带的标准，sodC检测显示出 100% 的敏感性，但特异性仅为 13%。PPV 为 12%，NPV 为 100%。这意味着在sodC阳性样本中，只有 12%（以porA为金标准）是真正携带脑膜炎奈瑟菌的样本，而所有sodC阴性样本均为真正的阴性样本。
根据扩增强度，sodC RT-PCR 阳性结果可分为三组。一组具有强荧光和良好的扩增曲线，这些样本sodC和porA均为阳性。另外两组分别是 “中等” 扩增组和较弱、较平坦的扩增组，后者中sodC阳性 /porA阴性样本比例较高。
讨论
本研究证实，与以porA PCR 为标准相比，sodC检测虽能检测到脑膜炎奈瑟菌，但特异性不可靠。这意味着仅依靠sodC RT-PCR 无法准确鉴定脑膜炎奈瑟菌，只有同时结合porA RT-PCR 结果（以porA为标准），才能检测到真正的阳性样本。因此，仅使用本研究中描述的sodC检测进行脑膜炎奈瑟菌携带筛查是无效的，因其存在非特异性。不过，若在多重检测中使用sodC检测，同时针对其他细菌（如流感嗜血杆菌），则可减轻非特异性问题，提高整体准确性。此外，与ctrA不同，sodC是 IMD 的有效诊断靶点，能检测到有荚膜和无荚膜的脑膜炎奈瑟菌。
由于研究设计的限制，无法检测流感嗜血杆菌和其他sodC假基因携带者，因为参与者的同意仅限于脑膜炎奈瑟菌携带筛查。尽管存在这些限制，本研究仍表明，所述的sodC检测能够检测青少年咽拭子样本 DNA 提取物中的脑膜炎奈瑟菌携带情况。然而，虽然sodC检测与porA检测具有相同的敏感性，但特异性显著较低，以porA为标准时，88% 的sodC阳性样本被认为是假阳性。
本研究中使用的原始 “B-Part-of-It” 研究的两个 W 血清群样本sodC检测呈阳性。但在验证过程中，W 血清群对照菌株使用sodC检测未扩增，而使用porA和ctrA检测均为阳性。序列比对和 BLAST 搜索证实，所有已知脑膜炎奈瑟菌菌株（包括 W 血清群）都含有sodC基因，理论上检测时应能扩增。W 血清群对照菌株未能扩增的原因尚不清楚，需要进一步研究（如全基因组测序）来探索脑膜炎奈瑟菌 W 菌株中可能存在的sodC缺陷，这超出了本研究的范围。
为检查 2017 年研究中 -80°C 储存的样本 DNA 是否降解，对 91 份样本重新进行porA检测。结果与 2017 年 “B-Part-of-It” 研究数据中的阳性结果一致，排除了 DNA 提取物降解和交叉污染是导致sodC和porA检测结果差异的因素，也证实了冷冻保存长达 5 年的 DNA 提取物可用于基于 RT-PCR 的研究。不过，长期保存的影响仍未知。虽然这一观察仅基于对 91 份样本的porA检测，但所有样本板的处理和储存程序一致，表明这些问题在整个测试样本集中不太可能很严重。
分析样本检测的荧光曲线时发现，sodC阳性 /porA阳性结果的一个子集扩增明显更高，但仅在部分已确认的sodC阳性样本中观察到。“中等强度” 和 “弱” 扩增组中均包含sodC阳性但porA阳性和porA阴性样本的混合。较弱、较平坦的扩增曲线样本可能是由于与其他微生物（如嗜血杆菌属）的交叉反应，这些微生物在探针结合位点和 / 或引物位点具有同源序列。但由于未进行进一步测序分析，难以得出确切结论。
与先前研究不同，本研究未为sodC检测设定特定的循环阈值限制，而是直接与 “B-Part-of-It” 研究中使用的方案进行比较。在本研究中，任何 CT 值在 40 及以下的porA扩增均被视为阳性。在原始 “B-Part-of-It” 研究中，porA RT-PCR 检测中，同时培养出脑膜炎奈瑟菌的porA阳性样本（因此确定为阳性）的 CT 值呈正态分布，但有相当数量的样本 CT 值为 40（未发表数据）。这表明咽拭子样本中特定脑膜炎奈瑟菌 DNA 的含量可能因定植程度不同而有很大差异。大部分检测样本（88.4%）sodC检测呈阳性，但只有 12% 的样本porA也呈阳性。虽然本研究中所有porA阴性但sodC阳性的结果均被视为假阳性，但值得注意的是，极少有关于porA缺陷的脑膜炎奈瑟菌分离株（包括有荚膜和无荚膜的）的报道。因此，sodC检测有可能在这些样本中检测到了porA缺陷的脑膜炎奈瑟菌，但这一可能性无法完全解释porA阴性和sodC阳性结果之间的巨大差异。
尽管存在上述问题，sodC作为检测青少年脑膜炎奈瑟菌的靶点已得到证实。本研究开发的检测方法有改进的潜力，当前形式也可能有特定的应用场景。虽然 LNA 探针在检测特异性上未显示出明显改善，但反向互补 LNA 探针可能会有效果。尽管存在特异性不足的问题，当前的检测方法仍可用于多重检测，以减轻这一弱点。
结论
sodC检测能够检测到脑膜炎奈瑟菌，但在检测咽拭子中脑膜炎奈瑟菌携带情况时特异性不足。这是因为该检测可能也会检测到咽拭子样本中的其他微生物，与包括嗜血杆菌属在内的其他微生物的交叉反应会导致假阳性结果，降低了检测脑膜炎奈瑟菌携带情况的可靠性。因此，虽然sodC检测可作为检测脑膜炎奈瑟菌携带情况的工具，但其特异性不足，在流行病学研究等场景中解读携带结果时需格外谨慎。
