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本文聚焦于 “Candidatus Arsenophonus phytopathogenicus”（Ap）和 “Ca. Phlomobacter fragariae”（Pf）两种植物致病砷单胞菌。通过基因组分析，发现其从昆虫内共生菌转变为韧皮部病原体可能由少数水平基因转移事件介导，对研究细菌生活方式转变机制意义重大，值得关注。
### 引言
在维管植物中，韧皮部是糖分丰富的环境，也是致病微生物的生存 niche 。一些细菌感染局限于筛管元素（SEs），难以控制且会引发全球范围内的破坏性疾病。这些细菌通常无法体外培养，具有双相生活方式，在植物 SEs 和吸食汁液的半翅目昆虫载体之间交替生存。在
Pseudomonadota门中，媒介传播的韧皮部病原体有的源自植物相关细菌，有的则源自昆虫内共生菌，如
Arsenophonus属中的 “
Ca. Arsenophonus phytopathogenicus”（Ap）和 “
Ca. Phlomobacter fragariae”（Pf）。
Ap 由飞虱Pentastiridius leporinus和Cixius wagneri传播，可在甜菜的 SEs 中定殖，引发 “basses richesses”（SBR）综合征，且其分布和宿主范围不断扩大。Pf 由C. wagneri传播，会导致草莓边缘黄化（SMC）。除了这两种植物病原体，Arsenophonus属的其他菌株多为节肢动物内共生菌，该属是广泛分布的昆虫内共生菌属，宿主范围还包括蛛形纲动物等。Arsenophonus菌株与宿主的相互作用、组织嗜性和传播途径多样，其基因组架构也各不相同。
有诸多证据表明，Arsenophonus属可能起源于昆虫内共生菌，植物致病性是近期才出现的。因此，Ap 和 Pf 是研究从昆虫内共生菌向媒介传播的韧皮部病原体转变过程中遗传变化的理想模型。本研究通过对 Pf 和 Ap 进行基因组分析，探究这种转变的遗传机制。
结果
- 基因组组装的一般特征：Ap 和 Pf 的基因组大小在 2.6 - 2.9 Mb 之间，大于其他媒介传播的韧皮部病原体。通过混合组装方法获得的基因组具有较高的完整性，其中 Ap - CH 的组装效果最佳。三者的基因组 GC 含量约为 37%，与其他兼性内共生Arsenophonus菌株相似，且基因组大小、预测蛋白数量和假基因化率在属内处于中间位置。
- 噬菌体和质粒区域：尽管采用了多种组装方法和高测序覆盖率，但三个基因组仍无法完全闭合，可能包含染色体外元件。在 Ap - CH 和 Pf - FR 中发现了与已知Arsenophonus染色体外元件序列具有共线性的区域，还预测到了多个噬菌体区域。其中，Ap - CH 和 Pf - FR 都检测到了完整的噬菌体 DNA 聚合酶同源物，与Acyrthosiphon pisum次级内共生菌（APSE）噬菌体的 p45 聚合酶同源，且含有许多 APSE 基因。
- 系统发育关系：最大似然法和贝叶斯系统发育基因组分析表明，Ap 和 Pf 属于不同物种。Ap 菌株位于 “Triatominarum” 进化枝内，与该进化枝其他成员的平均核苷酸同一性（ANI）较高；Pf 是进化枝 I 的早期分支成员，与其他菌株的 ANI 较低。
- 基础生物合成能力：Arsenophonus菌株的生活方式和基因组大小多样，基础生物合成能力也存在显著差异。Ap 和 Pf 经历了中等程度的生物合成途径丧失，但仍保留了部分产能和获取营养的能力，这可能与它们在营养有限的环境中生存以及引发植物症状有关。
- 毒力和共生相关基因：Ap 和 Pf 保留了许多与毒力和共生相关的基因，这些基因可能在感染半翅目昆虫的过程中发挥作用，帮助细菌在肠道中生存、穿越细胞屏障、逃避免疫并到达生殖器官和唾液腺。它们具备产生脂多糖和肽聚糖的能力，拥有一些参与黏附、分泌系统和转运的基因，但缺乏鞭毛、菌毛和趋化性相关基因。
- Ap 和 Pf 特有的基因：通过同源性聚类分析，鉴定出 Ap 和 Pf 特有的 8 个同源组（OGs），包含 35 个基因。这些基因编码的蛋白质功能多样，如锌金属肽酶、噬菌体裂解蛋白、转录抑制因子等。其中，一些基因编码的酶可能与植物细胞壁降解和蛋白质水解有关，如 O - 糖基水解酶（OG3615）、C1A 半胱氨酸肽酶（OG3863，XLP）等，且这些基因与其他植物病原体或节肢动物内共生菌中的基因具有同源性。
- 计算机预测和基因表达分析：通过多种计算机预测工具分析，发现一些 Ap 和 Pf 特有的 OGs 编码的蛋白质可能具有分泌和特定的亚细胞定位。基因表达分析表明，部分基因在植物组织中的表达水平显著高于昆虫组织，如 DUF3757、脂肪酶 / 酯酶和细胞壁降解酶（CWDE）等，而 XLP2 在昆虫中的表达更高。
讨论
本研究首次对 Ap 和 Pf 进行基因组分析，虽因重复病毒序列导致基因组处于支架水平，但为后续研究奠定了基础。Ap 和 Pf 与其他Arsenophonus菌株，尤其是吸食汁液的半翅目昆虫的兼性内共生菌高度相似，其从昆虫内共生菌向植物病原体的转变可能仅涉及少数基因变化。
Ap 和 Pf 共有的一些基因，如可能的 CWDEs 和 XLPs，在植物阶段可能发挥重要作用。CWDEs 属于糖苷水解酶家族 GH30，可能参与植物多糖的降解，促进细菌在植物体内的系统性入侵或获取营养。XLPs 在多种植物致病Pseudomonadota中存在，可能作用于植物维管系统的蛋白质，且可能具有多种功能，既参与植物定殖，又有助于昆虫载体适应植物。
Ap 和 Pf 之间可能通过直接水平基因转移（HGT）交换了一些基因，这些基因可能最初来自其他Pseudomonadota。此外，Ap 和 Pf 可能在获得植物致病性状之前就具备了在韧皮部生存的能力，这使得它们有机会接触并获取其他植物病原体的基因。目前，许多吸食汁液的半翅目昆虫体内的Arsenophonus菌株功能尚未明确，未来有必要进一步研究它们的生物学和生态学特性。
总之，本研究支持了 Ap 和 Pf 进化过程中 “昆虫优先” 的情景，有限的 HGT 事件可能是其生活方式转变的关键机制，尤其是 CWDEs 和 XLPs 的获取和交换，可能是Arsenophonus植物致病性两次出现的基础。未来需要对这些酶及其底物进行生化表征，以进一步验证这一假设。
材料和方法
- 昆虫宏基因组的 DNA 提取：分别采集法国和瑞士的昆虫样本，采用不同的表面消毒和 DNA 提取方法，提取后的 DNA 样本经 RNase A 处理、氯仿 / 异戊醇萃取和异丙醇沉淀后，溶解于相应的缓冲液中。
- 细菌滴度的定量：通过 qPCR 对 DNA 样本中的细菌滴度进行估计，使用针对 Pf 的spoT基因的引物和探针，对不同样本进行检测，选择细菌滴度最高的样本进行高通量测序。
- 基因组测序和组装：对 Ap - CH 和 Pf - FR 进行长读长和短读长测序，使用多种混合组装器进行组装，并对组装结果进行优化和评估。对于 Ap - FR，由于样本保存时间较长，仅使用短读长测序进行组装。
- 功能注释：使用 NCBI PGAP 对三个基因组进行注释，通过多种工具确定 COG 类别、KEGG 本体术语、噬菌体区域等，评估生物合成能力，检测毒素和效应子。
- 系统发育基因组学和分类学：使用 Orthofinder 鉴定单拷贝同源物，通过多种系统发育方法构建系统发育树，计算 ANI 值，以确定 Ap 和 Pf 在Arsenophonus属中的分类地位。
- 泛基因组分析：使用 Orthofinder 进行同源性聚类分析，鉴定共享的 OGs，对 Ap 和 Pf 特有的基因进行功能分析和系统发育分析，通过计算机预测工具分析蛋白质的分泌和亚细胞定位。
- 基因表达分析：对 Ap - CH 的部分基因在P. leporinus雌性个体和长春花茎中的表达进行 RT - qPCR 分析，提取 RNA 并合成 cDNA，进行 qPCR 检测，对结果进行统计分析。
