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本文聚焦小鼠胚胎发育，研究发现 O-GlcNAc 这种细胞内蛋白糖基化修饰形式，在胚胎发育过程中具有重要作用。通过实验表明，扰动核 O-GlcNAc 会使胚胎发育变缓，但其并非影响胚胎基因组激活，为胚胎发育研究提供了新视角。
### 研究背景
在生命的起始阶段，哺乳动物的胚胎发育是一个极其复杂且精妙的过程。蛋白质的化学修饰在其中扮演着至关重要的角色，而糖基化修饰作为其中一种重要的形式，尤其是细胞内蛋白糖基化的主要形式 O-GlcNAc，近年来备受关注。O-GlcNAc 是一种可逆的单糖修饰，能够添加到数千种细胞质和细胞核蛋白上，参与众多基本的细胞活动，如糖酵解、细胞周期、转录和翻译等过程。从代谢的角度来看，O-GlcNAc 的供体底物 UDP-GlcNAc 是己糖胺生物合成途径的终产物，该途径与细胞内 2 - 3% 的葡萄糖代谢相关，并且其通量会对葡萄糖、谷氨酰胺等营养物质的水平做出响应，这使得 O-GlcNAc 与营养感知和细胞适应性紧密相连。
在哺乳动物的早期胚胎发育过程中，胚胎会经历一系列显著的变化。受精后，胚胎最初依赖卵母细胞携带的 RNA 和蛋白质来维持生命活动。随后，胚胎会进行全基因组重编程，这涉及到染色质组织的改变、转录组的重新配置，伴随着母源转录本的降解和胚胎基因组的激活。与此同时，蛋白质组也在发生着重新配置，其中就包括动态的翻译后修饰（PTMs），然而细胞内糖基化在早期哺乳动物胚胎中的特征和作用却鲜为人知。
在动物体内，O-GlcNAcylation 由一对特定的酶来催化，即 O-GlcNAc 转移酶（OGT）和 O-GlcNAc 水解酶（OGA），它们在大多数物种（包括人类和小鼠）中都由单个基因编码。在果蝇中，Ogt 功能缺失会导致幼虫发育出现异常，表现为同源异型基因在正常边界之外表达。在小鼠中，Ogt 基因敲除会引发更严重的表型，母源遗传的无功能 Ogt 拷贝会致使胚胎在囊胚阶段左右死亡，这暗示着哺乳动物的 OGT 和 / 或 O-GlcNAc 在卵母细胞发育或植入前过程中执行着不可或缺的功能。此外，OGT 在细胞增殖中也起着重要作用，且该作用独立于其酶活性。由于 Ogt 基因的这种关键性质，使得研究 O-GlcNAc 在哺乳动物胚胎中的功能面临诸多困难，其在细胞和发育过程中的相关性在很大程度上仍是未知的。
O-GlcNAc 修饰具有高度的多效性，它能够作用于众多的哺乳动物蛋白质，参与多种细胞通路。在细胞核中，O-GlcNAc 修饰众多转录因子，其中与发育密切相关的多能性主调节因子 OCT4（也称为 POU5F1）和 SOX2 备受关注。研究表明，OCT4 的 O-GlcNAcylation 修饰对于其在体外的重编程活性是必需的，这意味着 O-GlcNAc 可能在植入前发育过程中对多能性基因网络起到调控作用。另外，RNA 聚合酶 II 的 C 末端结构域（CTD）也是 OGT 的一个重要核靶点，O-GlcNAc 能够修饰其苏氨酸 4 和丝氨酸 5 位点。尽管 O-GlcNAc 存在于这些关键的基因表达调节因子上，但其在控制转录过程中是否具有指导性功能仍不明确。Ogt 功能缺失导致的早期发育停滞现象，与 O-GlcNAc 在胚胎首次转录事件 —— 胚胎基因组激活（EGA）中可能发挥的作用相契合，但这一假设尚未得到验证。
早期哺乳动物胚胎是一个高度代谢动态的系统。在胚胎发育的早期阶段，葡萄糖的摄取量较低，直到 8 细胞阶段都维持在一个相对稳定的低水平，并且在植入前发育过程中，糖酵解几乎难以检测到，此时胚胎主要依赖氧化磷酸化来获取能量。随着胚胎发育至植入阶段，氧气水平下降，同时由于细胞增殖和生物量生产的需求增加，胚胎的代谢方式会发生转变，开始倾向于糖酵解。基于这些研究发现，早期胚胎发育极有可能受到像 O-GlcNAc 这样的代谢敏感型 PTM 的调控。然而，目前关于哺乳动物 O-GlcNAc 在早期发育中可能作用的假设大多是基于体外实验证据，在体内尚未得到充分验证。这主要是因为 Ogt 母源等位基因的需求给经典遗传学研究方法带来了很大的阻碍。在本研究中，科研人员深入探究了 O-GlcNAc 在小鼠植入前关键发育阶段的动态变化，并通过实验揭示了其在胚胎发育过程中的重要作用，为这一领域的研究提供了新的见解和突破。
研究结果
- 小鼠植入前发育过程中 OGT 和 O-GlcNAc 的动态变化：为了深入了解早期小鼠胚胎中蛋白质 O-GlcNAcylation 的动态变化，研究人员对 OGT、O-GlcNAc 和 OGA 在关键植入前阶段的时空分布进行了研究。实验采用体外受精（IVF）技术获取胚胎，并收集了不同阶段的样本，包括未受精的 MII 卵母细胞、不同原核（PN）阶段的受精卵、晚期 2 细胞阶段胚胎、桑葚胚和晚期囊胚，随后对这些样本进行免疫荧光染色分析。
研究发现，在受精卵的原核阶段，OGT 信号在父源原核中相较于母源原核呈现出明显的富集现象，这一结果与之前的研究一致，并且通过自然交配获得的胚胎也呈现出相同的模式。然而，O-GlcNAc 信号在父母源原核中的分布是均匀的，OGA 信号同样如此，这表明在受精卵中，OGT 可能具有不依赖于催化活性的功能。从 2 细胞阶段开始，O-GlcNAc 的核质信号比显著增加，而 OGT 信号在细胞核和细胞质中的分布大致相同，OGA 则在细胞核中更为丰富，且从受精卵阶段开始直至整个植入前发育过程中都是如此。在亚核层面，OGA 和 O-GlcNAc 呈现出独特的分布特征，它们与 DAPI 密集区域相互排斥，这意味着核 O-GlcNAc 修饰的蛋白质及其水解酶可能被排除在浓缩染色质和 / 或与 A/T 富集 DNA 结合的蛋白质之外。此外，在中期染色体上无法检测到 OGT、OGA 和 O-GlcNAc，而 OGT 在卵母细胞减数分裂纺锤体上富集，OGA 则没有。
研究人员进一步分析了 OGT 和 OGA 的 mRNA 异构体在早期胚胎中的表达情况。通过对公开的 mRNA-Seq 数据进行分析，发现卵母细胞中仅存在编码 ncOGT 的全长转录本，受精后其水平逐渐下降，直到 8 细胞阶段才开始再次上升。在胚胎基因组激活（EGA）至 8 细胞阶段，存在一种较短形式的 Ogt 转录本，该转录本终止于全长异构体的内含子 4 内，可能对应于 Ensembl 中注释的较短 N 端异构体之一，由于其缺乏 C 端催化结构域，被预测为无编码功能或至少催化活性丧失。对于 Oga，在受精卵中存在少量母源 Oga 转录本，在植入前阶段会产生两种 mRNA 异构体，且表达水平相对较低，分别为全长异构体和一种无功能异构体（缺失外显子 11 和最长异构体的 C 端外显子）。在植入前后，功能性胚胎 Oga 转录本的表达量会显著增加。
综上所述，在小鼠植入前发育过程中，O-GlcNAc 修饰的亚细胞模式呈现出高度的动态变化，且与 OGT 的分布模式截然不同。早期胚胎中 OGT 的浓度似乎受到严格调控，最初通过限制其在父源原核中的分布，随后通过产生不同的 RNA 异构体，导致在 8 细胞阶段之前几乎不存在具有催化活性的胚胎 OGT，因此早期阶段的核 O-GlcNAc 模式主要由母源的 OGT 和 O-GlcNAc 以及水解酶 OGA 在不同亚细胞区室中的差异分布所决定。
2. 有效酶促去除小鼠胚胎细胞核中的 O-GlcNAc：鉴于从 2 细胞阶段起细胞核中 O-GlcNAc 修饰蛋白质的高丰度，研究人员希望探究 O-GlcNAcylation 在植入前发育过程中对核蛋白的具体功能。为了实现这一目标，他们设计了一种实验系统，通过表达靶向细胞核的重组细菌 O-GlcNAcase 来酶促去除从受精卵开始的 O-GlcNAc 基团。研究人员选用了来自人类肠道共生菌 Bacteroides thetaiotaomicron 的同源 O-GlcNAcase（BtGH84），其结构和催化机制在体外已被充分研究。由于 B. thetaiotaomicron 缺乏哺乳动物 OGT 的同源物，因此 BtGH84 不太可能干扰内源性 OGT 和 OGA 的功能，也不会与它们的内源性相互作用蛋白结合。研究人员将 BtGH84 与核定位信号融合，并在 N 端连接 EGFP 报告基因以监测单细胞水平的表达。在 IVF 后 2 小时（~PN3），将编码该融合蛋白的 mRNA（简称 “Btgh”）注射到受精卵中。同时设置了两组对照组，分别为未注射的胚胎和注射了催化失活的 Btgh 构建体（dBtgh，携带 D242A 单点突变，使 Vmax和对底物的亲和力 Km降至可忽略不计的值）的胚胎。
注射 Btgh 后，在早期 2 细胞阶段（即 EGA 之前），O-GlcNAc 信号就急剧下降至几乎无法检测的水平，而注射 dBtgh 的胚胎中 O-GlcNAc 信号与未注射胚胎相当。研究人员使用不同的抗 O-GlcNAc 抗体进行检测，进一步证实了 O-GlcNAc 的广泛缺失。这种核 O-GlcNAc 的缺失在桑葚胚阶段仍然显著，并持续到晚期囊胚阶段（胚胎第 4 天；E4），这表明该实验方法能够有效地去除胚胎细胞核中的 O-GlcNAc。
3. 核 O-GlcNAc 缺失对胚胎发育的影响：在验证了扰动方法的有效性后，研究人员进一步研究了核 O-GlcNAc 缺失对植入前发育进程的影响。他们发现，在体外培养至 E4 时，核 O-GlcNAc 缺失对囊胚形成率没有显著影响，对滋养外胚层（TE）和内细胞团（ICM）谱系的特化也没有影响，这表明生理水平的核 O-GlcNAc 对于胚胎发育至囊胚阶段并非必需。这一结果与之前在体外研究中发现的多能性主调节因子 OCT4 的糖基化修饰对其重编程功能至关重要的结论有所不同，是一个意外的发现。
为了研究核 O-GlcNAc 扰动在生理营养和气体条件下对植入前和植入期发育的影响，研究人员将注射了 Btgh 或 dBtgh mRNA 的受精卵在体外培养过夜，然后将所得的早期 2 细胞阶段胚胎通过手术转移到假孕雌性体内，并在 6 天后（胚胎第 7 天；E7）进行解剖。结果显示，两组注射胚胎在 E7 时的回收率没有显著差异，这表明核 O-GlcNAc 的缺失对胚胎植入没有不利影响。
虽然基于中胚层出现情况对 E7 胚胎进行分期时，发现两组胚胎处于 Pre - Streak、Early - Streak 或 Mid - Streak 阶段的比例相似，但核 O-GlcNAc 缺失的胚胎平均尺寸较小。为了进一步从分子层面评估这一形态学观察结果，研究人员对两组实验的单个 E7 胚胎进行显微切割，分离出上胚层（epi）和胚外外胚层（ExE），并对单个胚胎半体进行 mRNA-Seq 分析。分析结果显示，在 ExE 中两组胚胎的基因表达没有差异，但在 epi 中存在多个差异表达基因（adj. P-value < 0.05，任意 log2FC）。基因集富集分析（GSEA）发现，注射 Btgh 的胚胎中，与中胚层发育相关的基因下调，而与 DNA 甲基化相关的基因上调。中胚层的发育标志着 E6.5 至 E7.5 的过渡，而哺乳动物原肠胚形成的开始与从头 DNA 甲基化同时发生，参与这一过程的酶在 E5.5 时表达达到峰值，随后逐渐下降。因此，注射 Btgh 的 E7 胚胎上胚层的转录组类似于稍早发育阶段的转录组，这意味着胚胎发育出现了延迟。通过对 E7 中胚层标记物和 DNA 甲基化酶在单个胚胎中的表达分析，进一步支持了植入前核 O-GlcNAc 缺失会导致植入后胚胎发育延迟的结论。
4. 核 O-GlcNAc 与胚胎基因组激活的关系：受精卵注射 Btgh 后导致的植入后发育延迟，可能是由于之前阶段核 O-GlcNAc 缺失所引起的扰动。因此，研究人员对在 EGA 后 2 细胞、桑葚胚和囊胚阶段收集的单个 O-GlcNAc 缺失的植入前胚胎进行了单细胞 mRNA-Seq 分析。主成分分析（PCA）结果显示，O-GlcNAc 缺失的桑葚胚与对照组相比，在转录组上与囊胚的距离更远，这表明核 O-GlcNAc 去除导致胚胎发育出现延迟，且这种延迟在桑葚胚转录组中已经有所体现。
研究人员还发现，植入前胚胎的核 O-GlcNAc 信号在 2 细胞阶段急剧增加，且这一增加与 EGA 同时发生。为了探究核 O-GlcNAc 缺失是否会改变 EGA 过程，研究人员将本研究中的 2 细胞<
