探秘水稻增产 “密码”：NAL1 调控 FZP 相分离的分子机制及育种新契机

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：NAL1 forms a molecular cage to regulate FZP phase separation

本文聚焦水稻（Oryza sativa）中 NAL1 基因，研究发现其编码的蛋白酶以独特六聚体分子笼结构，调节 FZP 蛋白相分离，影响转录活性，进而促进水稻穗分化、提高产量。这为植物生物学研究及作物育种提供了重要理论依据和策略指导。

　　

NAL1 和 FZP 基因对水稻的重要作用

在水稻的基因世界里，有两个基因备受瞩目，它们就是 NAL1（NARROW LEAF 1）和 FZP（FRIZZY PANICLE）基因 。NAL1 基因最初是在水稻窄叶突变体中被发现的，它可不仅仅影响叶片形态，还在植物的生长素极性运输、光合作用速率、根体积以及穗粒数等多个重要农艺性状方面发挥作用。研究发现，从热带粳稻地方品种中挖掘出的 NAL1 等位基因，能显著提高现代籼稻品种的产量，让水稻产量实现 13% - 36% 的增长，且对稻谷外观没有不良影响。

FZP 基因同样意义非凡，它在野生稻向驯化稻转变过程中，对于增加二级枝梗数量、提高谷物产量起着关键作用。NAL1 与 FZP 在遗传和物理层面紧密相连，NAL1 能够促使 FZP 蛋白降解，二者之间的这种关系影响着水稻的穗形态和谷物产量，共同为水稻的生长发育和产量提升 “保驾护航”。

NAL1 的结构特征

为了深入探究 NAL1 基因发挥多效性作用背后的分子机制，科研人员采用了多种技术手段，对两种 NAL1 变体（NAL1^SPIKE和 NAL1^IR64）的结构进行解析。结果发现，单体 NAL1 蛋白由三个不同的结构域组成：N 端结构域（NTD，aa: 1 - 88）、ATP 结合结构域（ABD，aa: 89 - 172）以及丝氨酸蛋白酶结构域（SPD，aa: 184 - 458） 。

其中，ABD 结构独特，含有四个 β - 链、一个弯曲的 α - 螺旋和两个无规环，ATP 就结合在这些环中。ATP - Mg²⁺复合物主要位于环之间，与多个氨基酸残基相互作用。值得注意的是，NAL1 的 ATP 结合口袋与典型的解旋酶和 AAA + 家族蛋白酶不同，它既不是由带有典型 Walker A 或 B 基序序列的两个结构域形成，也不是亚基共享的。而且，有无外源 ATP 存在时，NAL1 的蛋白水解活性并无变化，这表明 ATP 结合主要是为了稳定环的构象，可能与蛋白质 - 蛋白质相互作用有关。

SPD 结构域包含两个六链 β - 桶，典型的催化三联体裂隙（H234、D291 和 S385）就位于这两个桶之间，它与典型的丝氨酸蛋白酶家族结构相似，具备催化、底物识别和酶原激活等组件 。同时，在 NAL1 中还存在一条特殊的 β - 链（β - strand 11，aa: 264 - 271），它连接了第一个 β - 桶中的 β - strand 10 和 β - strand 13，与 N 端的 β - strand 1 形成一对平行 β - 链，在六聚体组装过程中发挥重要作用。

NAL1 的六聚体结构及功能

进一步研究发现，部分 NAL1 变体（如 NAL1^{SPIKE(31 - 458)}、NAL1^{IR64(36 - 458)}和 NAL1^{SPIKE(46 - 458)}）能够形成六聚体结构 。在这个结构中，两个三聚体沿着晶体学二重轴结合在一起，分子在三聚体内通过 120° 旋转相关，两个三聚体之间则通过垂直的 180° 旋转相关，形成具有 D3 对称性的六聚体。从侧面看，六聚体呈两层结构，厚度约 89.7 ?，整体尺寸为 119.2 ?。

三聚体内单体之间的相互作用源于 ABD 和 SPD 之间的界面，主要通过疏水相互作用，掩埋的总表面积达到 1991 ?²。而两个三聚体组装成稳定六聚体，是通过不同三聚体亚基之间形成分子间 β - 片层实现的。N 端的 β - strand 1（aa: 48 - 53）与底部三聚体中 SPD 的 β - strand 11（aa: 264 - 271）以反平行方式相互缠绕，形成一个 4 链反平行 β - 片层 。此外，一对分子间二硫键（C61 和 C41 之间）进一步加强了两个三聚体之间的相互作用。

这种特殊的组装方式使得六聚体形成了三个较大的通道和一个中央大腔。通道分别由顶部和底部三聚体中相邻亚基相互作用形成，每个通道表面积约 320 ?²，总掩埋表面积达 2529 ?² 。中央腔形成了一个约 25000 ?³的球形催化室，含有指向腔中心的蛋白水解活性中心。底物可以通过约 20 ? 瓶颈直径的中央通道或约 11.4 ? 瓶颈直径的侧向通道进入催化室。通道直径的差异表明，NAL1 可能借此区分不同的底物，因为它能够水解构象和分子量差异很大的 FZP 和 OsTPR2 两种底物，并发挥不同的生理作用。

研究还发现，六聚体结构对于 NAL1 的蛋白水解活性至关重要。通过尺寸排阻色谱结合小角 X 射线散射（SEC - SAXS）分析不同截短形式的 NAL1 在溶液中的寡聚状态，结果显示全长 NAL1^SPIKE和 NAL1^{SPIKE(31 - 458)}以六聚体形式洗脱，而 NAL1^{SPIKE(88 - 458)}则以三聚体形式洗脱，这与晶体结构结果一致 。而且，蛋白水解实验表明，六聚体形式的 NAL1 才有蛋白水解活性，三聚体形式则活性受损。比较不能形成六聚体的 NAL1^{IR64(88 - 458)}三聚体和能形成六聚体的 NAL1^{IR64(36 - 458)}六聚体结构发现，六聚体中分子间的接触对于维持包含催化 H234 的 loop 232 - 244 的正确构象至关重要 。在游离三聚体中，该 loop 暴露在溶剂中，R438 与 D291 形成强离子相互作用，导致 D291 侧链远离 H234，使得催化三联体位置错误，无法正常发挥作用；而在六聚体中，该 loop 位于堆叠六聚体的界面，能够形成与催化相适应的构象。

FZP 的相分离现象

在对 FZP 进行蛋白水解实验时，科研人员发现 FZP 容易变得不溶，这一现象引发了他们对 FZP 相分离特性的研究 。利用微分干涉对比（DIC）显微镜和浊度测量实验，证实了 FZP 能够形成相分离液滴。这些液滴的数量和大小随着蛋白浓度的增加而增加，呈现出典型的相分离特征。

通过 AlphaFold2 预测发现，FZP 由一个中央结构化结构域和两侧的非结构化区域组成，N 端有 126 个氨基酸的非结构化区域，C 端也有一个较大的非结构化片段 。NAL1 对 FZP 的水解位点分别是 H117 和 H195，水解后会产生三个片段：F1（aa 1 - 116），包含结构化的 DNA 结合结构域（AP2/ERF 结构域，aa: 54 - 114）和 N 端的非结构化区域；F2（aa: 117 - 195），释放出一个内在无序区域（IDR，86 个氨基酸）；F3（aa: 196 - 318），含有反式激活结构域（AD，aa: 246 - 268） 。

研究发现，含有 IDR 的 FZP 片段更容易发生相分离，而缺失 IDR 的片段则不易形成液滴 。为了进一步验证 IDR 在相分离中的作用，科研人员构建了多种 FZP 片段进行实验。结果显示，无论是 DIC 显微镜观察还是浊度测量，都表明 IDR 的存在与相分离密切相关，至少在体外实验中，FZP 通过 IDR 形成凝聚物。

在活细胞实验中，科研人员将 GFP 与全长 FZP（FZP^FL）以及两个 FZP 片段（包含 IDR 的 FZP^{51 - 244}和缺失 IDR 的 FZP^Core）融合，构建荧光嵌合体 。将这些 GFP 标记的 FZPs 在烟草和水稻原生质体中瞬时表达后发现，FZP^FL在烟草叶细胞的细胞核和细胞质中呈现出特征性的点状模式，在水稻原生质体中 FZP^FL和 FZP^{51 - 244}都能形成凝聚物；而 GFP 单独表达以及 GFP 标记的 FZP^Core则在细胞中呈弥散分布 。此外，通过荧光漂白恢复（FRAP）实验发现，烟草细胞中约 66.5% 的 FZP^FL - GFP 分子在焦点处与周围溶剂中的分子发生交换，平均恢复半衰期为 15 s；在体外重构的 FZP^FL - GFP 液滴中，荧光恢复率则超过 90% 。这些结果充分表明，FZP 在体外和体内都具有形成凝聚物的内在倾向。

NAL1 对 FZP 凝聚状态的调控

为了探究 NAL1 如何调节 FZP 的凝聚状态，科研人员将 FZP 和 NAL1 分别标记上 GFP 和 mCherry，在烟草细胞和水稻原生质体细胞中瞬时共表达 。通过观察不同波长下的荧光图像发现，两种蛋白在细胞中均能良好共表达。单独转染 FZP - GFP 的细胞中形成明显的点状结构，而与 NAL1^SPIKE共表达时，FZP 的点状结构显著溶解；与水解活性较弱的 NAL1^IR64共表达时，仍能观察到少量可见的 FZP 点状结构；与水解活性比野生型 NAL1^SPIKE更高的突变体 NAL1^H233M共表达时，FZP 的点状结构则完全分散，在细胞中均匀分布 。

科研人员还研究了 NAL1 六聚体结构完整性对其调节 FZP 相凝聚的影响。将只形成三聚体而不形成六聚体的 N 端截短的 NAL1^{SPIKE(88 - 582)}与 FZP - GFP 共转染，结果发现 FZP 仍然形成与单独转染 FZP - GFP 时类似的点状结构 。这些实验充分证明，NAL1 及其分子笼结构的完整性在调节细胞内 FZP 的相分离和凝聚物分布中起着关键作用。

NAL1 对 FZP 转录活性的影响

科研人员进一步研究了 NAL1 催化 FZP 水解对其功能的影响，测量了多种 FZP 片段与全长 FZP 的 DNA 结合能力 。结果发现，DNA 结合数据呈现双相曲线，随着 FZP 蛋白浓度的增加，DNA 结合能力先急剧上升，然后逐渐下降 。例如，当全长 FZP 和 FZP^{51 - 195}的浓度分别超过 10 μM 和 40 μM 时，它们的 DNA 结合分数就会下降。其他片段的 DNA 结合能力则明显低于全长 FZP 和 FZP^{51 - 195} 。

结合 FZP 相分离实验结果可以推断，水解后的 FZP 片段由于缺乏 IDR 序列，不会促进凝聚，而处于非凝聚状态；同时，双相曲线表明在最佳 FZP 浓度（约 10 μM）时，DNA 结合能力最强，当浓度高于此阈值时，FZP 及其含 IDR 的变体发生凝聚，导致 DNA 结合效率降低，这说明在可溶性 FZP 和凝聚态 FZP 之间达到平衡时，DNA 结合最为有效 。

为了验证 NAL1 能够优化 FZP 凝聚物形成，从而激活细胞中 FZP 的转录活性这一假设，科研人员利用双荧光素酶（LUC）报告基因检测系统进行了瞬时实验 。将含有五个酵母 GAL4 结合位点与 LUC 融合的报告基因 GAL4 - TATA - LUC、由 FZP 编码区与 GAL4 DNA 结合结构域融合的效应质粒 GAL4BD - FZP，以及受花椰菜花叶病毒 35S 启动子控制的 NAL1，共同导入烟草和水稻原生质体细胞中 。结果发现，与报告质粒和 FZP 效应质粒共表达相比，同时转染 NAL1^IR64质粒使 LUC 活性增加了 3.0 倍；当用 NAL1^SPIKE替换 NAL1^IR64时，LUC 报告信号更强 。这些结果有力地证明，NAL1 通过其水解活性，将 FZP 凝聚物调节到最佳程度，从而增强了 FZP 的转录活性。

研究结论与展望

本研究深入揭示了 NAL1 基因在水稻生长发育过程中的重要作用机制 。NAL1 蛋白以独特的六聚体分子笼结构发挥蛋白酶功能，通过调节 FZP 蛋白的相分离状态，影响其转录活性，最终促进水稻穗分化，提高谷物产量 。这一发现为理解植物生物学中基因调控网络提供了新的视角，也为作物育种提供了极具价值的策略指导。

在未来的研究中，可以进一步探索 NAL1 与其他底物之间的相互作用机制，以及这种调控机制在不同环境条件下的变化规律 。此外，基于本研究结果，有望通过精准调控 NAL1 基因或其相关通路，培育出更高产、更优质的水稻品种，为全球粮食安全做出更大贡献。