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为解决质子束相对生物学效应（RBE）存在不确定性导致治疗方案欠佳及危及器官毒性问题，来自多单位的研究人员开展利用 3D 打印微组织盒测定质子 RBE 的研究。结果显示不同细胞存活率下 RBE 各异，且该方法可靠。其可提高检测通量，减少临床负担 。
质子束疗法（Proton beam therapy）是一种越来越常用的外部放射治疗方式，依靠高能质子来治疗肿瘤。质子治疗的特点是在传递剂量时会出现一个尖锐的峰值，随后迅速下降，这被称为布拉格峰（Bragg peak），与传统的 X 射线放射治疗相比，它能够消除不必要的出射剂量。在临床放射治疗中，质子束通常通过扩展布拉格峰（SOBP）来传递，以确保肿瘤组织能均匀吸收剂量，同时减少对附近健康组织的剂量。有证据表明，与 X 射线相比，质子会产生独特的放射生物学效应。这种差异用相对生物学效应（RBE）的概念来表示，RBE 是一种相对度量，用于衡量给定类型的辐射在生物组织中每沉积单位能量所造成的损伤与 X 射线相比的情况。目前的质子治疗计划通常采用 1.1 的通用质子 RBE 值。然而，现在已经明确，质子的 RBE 并不是恒定的，它会基于物理因素（剂量、剂量率、线性能量转移、分次照射）和生物学因素随深度增加 。例如，由于 RBE 与带电粒子（即质子）的线性能量转移（LET）直接相关，它会随着能量的降低而增加，而能量在被治疗的大体肿瘤体积内变化很大。实验报道了在扩展布拉格峰（SOBP）范围内 RBE 的变化（例如，入口处约为 1.1，中心处约为 1.15，远端边缘约为 1.35，远端下降区约为 1.7 ）。最近的一篇综述报告称，基于各种癌症的临床和体外细胞存活数据，最大的目标 RBE 值分别为 1.7 和 2.3 。在扩展布拉格峰（SOBP）的远端下降区，质子束线性能量转移的增加对 RBE 的不确定性有很大影响。例如，基于 U87 细胞计算出的 RBE 为 3.5，并且对于远端下降区的放射敏感细胞，RBE 的变化效应更为明显。比如，用 2Gy 的质子照射 HTB 140 黑色素瘤细胞，在远端下降区测定的 RBE（细胞杀伤）为 7.14 。对与 DNA 双链断裂修复相关的 γ-H2AX 焦点进行量化后发现，在布拉格峰后 6mm 处，质子的 RBE（通过细胞杀伤测量）在照射后 3 小时为 4，在质子照射后 24 小时显著增加到 6 。
这些在临床环境中质子束 RBE 的不确定性，以及更广泛意义上的放射生物学效应的不确定性，可能会导致局部控制效果不佳和对危及器官造成不必要的毒性。这种知识上的差距凸显了对更多放射生物学研究的需求，特别是需要一种强大的实验和标准化方法来量化 RBE 与生物学读数之间的相关性。
已经提出了几种体外实验设置来解决质子 RBE 的不确定性问题。例如，Guan 等人设计了一个夹具，基于克隆形成试验来对与线性能量转移（LET）相关的生物学效应进行空间映射 。然而，由于线性能量转移（LET）从扩展布拉格峰（SOBP）的入口到峰值的固有特性，这种设置无法在质子扩展布拉格峰（SOBP）上均匀地对生物学效应进行采样，特别是在远端下降区。此外，使用 96 孔板虽然提高了通量，但播种细胞的最大数量限制了基于克隆形成试验评估高存活分数的可行性。还设计了一种平行板腔室，在蜗杆驱动扫描仪的支持下固定显微镜载玻片，并将样品定位在扩展布拉格峰（SOBP）上以 1 毫米的增量进行质子束照射。体外 γ-H2AX 试验用于测量 DNA 双链损伤和修复的生物学终点，以进一步量化 RBE。然而，这种低通量的设置每次只能在特定位置容纳一个样品进行质子照射，这大大增加了人员的负担，并且对临床设施的使用效率不高 。
在这项工作中，研究人员报告了一种可靠的分析方法，以解决与包括质子治疗在内的带电粒子放射治疗相关的长期存在的放射生物学问题。为此，研究人员使用 3D 打印技术制造了具有高空间分辨率的微组织盒，能够以高通量的方式严格测量沿扩展布拉格峰（SOBP）的质子能量与质子放射生物学效应之间的关系。最先进的 3D 打印机能够实现亚毫米级的打印分辨率，使得可以沿着扩展布拉格峰（SOBP）精确地检测微组织样品的带宽。研究人员首先使用金标准克隆形成试验验证了微组织盒的可靠性，以确定沿质子扩展布拉格峰（SOBP）的细胞存活分数和 RBE，随后分析了 DNA 双链断裂（DSB）修复情况，包括 γ-H2AX 荧光定量（以确定生物学 RBE）、焦点数量和形态。
实验材料包括 U87 胶质母细胞瘤细胞（来自美国模式培养物集存库 ATCC）、高糖杜氏改良 Eagle 培养基（Gibco?，美国）、iBidi-treat 塑料盖玻片（7.5cm×2.5cm，iBidi，德国）、Alexa Fluor? 488 抗 H2A.X 抗体（Biolegend，美国）、磷酸化组蛋白 H2A.X（丝氨酸 139）抗体 #2577（Cell Signaling Technology，美国）。
U87 细胞在含有 10% 胎牛血清（FBS，Gibco，英国）和 1% 链霉素 / 青霉素（Gibco，英国）的 DMEM 培养基中，在湿度培养箱（5% CO2，37°C）的 10cm 培养皿中培养。
微组织盒由 Autodesk Illustrator 设计，包含间距为 1mm 的栏杆，用于放置塑料盖玻片，并且在盖子的中心有一个开口，用于去除细胞培养基中的气泡。值得注意的是，该打印机能够打印亚毫米级的间距，如果需要，可以很容易地提供更高的空间分辨率，以更高的空间精度研究质子扩展布拉格峰（SOBP）。
研究人员通过克隆形成试验和体外 γ-H2AX 试验，基于 3D 打印的微组织盒，系统地确定了沿扩展布拉格峰（SOBP）包括远端下降区的质子 RBE，这是一种创新且可靠的实验方法。微组织盒的设计实现了高空间分辨率和高通量测量，这是临床放射治疗设施中此类放射生物学测量的两个重要特征。研究结果进一步证明了对质子 RBE 的低估情况。
