构建嵌合辅因子：解锁甲基转移酶介导的 prenylation 新路径，拓展生物催化烷基化边界

本文构建了 AdoMet/DMAPP 嵌合辅因子（AdoPrenyl），使甲基转移酶（MTases）发挥 prenyltransferases 功能。实验表明，该嵌合辅因子活性高，MTases 催化 prenylation 优先于甲基化。此研究拓展了 prenylation 范围，为生物催化烷基化开辟新方向。

　　

引言

烷基化在调节小分子、脂质、核酸和蛋白质的化学及生物学特性方面意义重大，其中甲基化或烷基化能够大幅提升活性药物成分的效力。因此，选择性后期甲基化或烷基化策略备受关注。然而，化学烷基化虽简单廉价，但对复杂分子缺乏选择性。

烷基化酶具有区域、立体和化学选择性。转移酶分为两类，一类在酶类（EC）2.1 中负责一碳基团转移，另一类在 EC 2.5 中负责非甲基基团转移，它们攻击亲核底物时依赖不同的辅因子支架。异戊烯基转移酶（PTases）以二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）为辅因子转移 C₅单元，而甲基转移酶（MTases）利用S- 腺苷甲硫氨酸（SAM 或 AdoMet）进行 C₁转移 。目前尚不清楚这种差异是由烷基化化学本质决定，还是其他因素导致。MTases 数量丰富，作用底物广泛，但此前未发现其能转移异戊烯基、香叶基或法尼基残基。基于此，研究人员推测构建 DMAPP 和 AdoMet 的嵌合辅因子，可能使 MTases 转变为异戊烯基转移酶，这不仅能扩大 prenylation 的范围，还有助于探究不同酶类催化 C₁和 C₅转移的内在原因。

结果

1. 嵌合辅因子 AdoPrenyl 的制备与特性：研究设计了嵌合辅因子 AdoPrenyl，它在 AdoMet 支架的锍中心带有二甲基烯丙基（或异戊烯基）基团。尝试通过化学合成未成功，后采用酶促原位生成法。将带有异戊烯基部分的甲硫氨酸类似物 prenyl-homocysteine（1b）与 ATP，在经工程改造能接受空间位阻较大甲硫氨酸类似物的 MAT 变体（PC-MjMAT）作用下反应。结果显示，AdoPrenyl 可化学和酶促生成，但不稳定、反应活性高，其异戊烯基导致的降解途径与 AdoMet 及已报道的 AdoMet 类似物不同。
2. MTase 催化的 prenylation 反应：选用作用于小分子、DNA 和 RNA 的O-、C- 和N-MTases 进行级联反应，以测试原位形成的 AdoPrenyl 能否作为 MTase 催化 prenylation 反应的辅因子。实验发现，多种 MTases 能有效催化底物发生 prenylation 反应。如 RnCOMT^M40A/Y200L与原位形成的 AdoPrenyl 反应，可高效生成 prenylated 产物（5b），1 小时内转化率达 75% ，且产物区域异构体比例为 92:8；NovO 与 AdoPrenyl 反应，底物 4,5,7 - 三羟基 - 3 - 苯基香豆素（6）1 小时内转化率达 85%；Ecm1 与 AdoPrenyl 反应，底物二核苷酸 GpppA（7）30 分钟内转化率达 98%。同时，研究还进行了甲基化对照实验，发现 prenylation 反应速度更快。
3. 竞争实验与结果：为进一步探究 MTases 对 AdoPrenyl 和 AdoMet 的偏好性，进行了直接竞争实验。从等摩尔浓度的甲硫氨酸（1a）和 prenyl-homocysteine（1b）出发，进行 MAT/MTase 级联反应。结果表明，在所有测试的 MTases 中，prenylation 产物的生成量均高于甲基化产物。例如，PC-MjMAT/RnCOMT^M40A/Y200L级联反应 1 小时后，5a生成量为 6%，5b为 49%，prenylation 偏好性是甲基化的 8 倍；PC-MjMAT/NovO 级联反应中，6a生成量为 12%，6b为 80%，prenylation 偏好性约为 7 倍；PC-MjMAT/Ecm1 级联反应中，7a生成量为 5%，7b为 95%，prenylation 偏好性高达 19 倍。这表明 AdoPrenyl 是比 AdoMet 更好的辅底物，其异戊烯基形成的烯丙基阳离子稳定性更高，有利于转移反应，且实验选用的 MTases 具有 promiscuous 特性，减少了酶的空间位阻影响。
4. 靶向天然异戊烯基受体的实验：研究人员尝试用嵌合 AdoMet/DMAPP 辅因子靶向天然异戊烯基受体。以 DNA - MTase M.TaqI 为例，它可选择性甲基化腺嘌呤 N⁶ 位置保护 DNA。实验中，使用 pUC19 质粒，其每条 DNA 链上有四个识别位点，进行 PC-MjMAT/M.TaqI 级联反应。结果显示，使用1b时，DNA 受到保护，未被限制性内切酶 R.TaqI 切割，与使用1a的阳性对照效果相似，表明天然甲基化位点可被嵌合 AdoPrenyl prenylation。
5. 拓展至更长链异戊二烯部分的研究：合成了带有更长链异戊二烯部分的甲硫氨酸类似物 geranyl-d/l-homocysteine（1c，C₁₀）和 farnesyl-d/l -homocysteine（1d，C₁₅），并测试其与 ATP 在 PC-MjMAT 作用下的反应。结果发现，它们可形成相应的 AdoMet 类似物并发生降解，虽效率低于1b ，但在 PC-MjMAT/M.TaqI 级联反应中，1c和1d能使 DNA 完全被修饰，实现甲基化、prenylation、香叶基化和法尼基化。
6. 点击化学相关应用研究：设计了带有可点击基团的甲硫氨酸类似物 PrenYneHcy（1e），其带有末端炔烃用于点击化学。合成1e并测试其酶促形成的 AdoMet 类似物 AdoPrenYne（2e）及降解途径，发现2e保留了 AdoPrenyl 的降解和转移特性。进行 PC-MjMAT/Ecm1 级联反应，证实可有效生成修饰的 mRNA 5′帽二核苷酸7e 。竞争实验表明，点击性异戊烯基的转移偏好性比甲基化高 8 倍以上。利用铜（I）催化的叠氮 - 炔环加成反应（CuAAC），使7e与生物素 - 叠氮结合，形成生物素化的 5′帽7f ，转化率达 94%，实现了在 AdoMet 存在下的高效点击标记。

讨论

研究表明，promiscuous MTases 可利用 AdoMet 支架高效转移异戊烯基。通过化学 - 酶促方法成功制备了新型嵌合辅因子 AdoPrenyl、AdoGeranyl 和 AdoFarnesyl，并测试了它们与不同 MTases 的兼容性。这些嵌合辅因子分解迅速且途径独特，需原位生成和使用。不同长度异戊二烯部分的甲硫氨酸类似物可被工程化 MAT 酶转化，prenylation 级联反应广泛适用于各类 MTases。在直接竞争级联反应中，prenylation 优于天然甲基化，且点击性异戊烯基在转移过程中优势明显，可用于 mRNA 5′帽的标记。

此研究将 MTases 转变为高效的异戊烯基转移酶，表明 C₁和 C₅转移由不同酶类催化并非基于内在化学或酶学原因。研究成果拓宽了 prenylation 的范围，实现了 MTase 辅助的区域和序列选择性 prenylation，有助于形成拟天然产物和新型异戊二烯 - DNA 共轭物，在生物催化烷基化领域具有重要意义。