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本文聚焦肝细胞癌（HCC），深入探讨 3D 培养技术在重构其肿瘤微环境方面的进展。阐述了多种 3D 培养模型，如球体模型、类器官模型等，分析其优缺点及应用，还研究了肿瘤微环境中细胞与基质成分的作用，为 HCC 研究提供了重要参考。
### 肝细胞癌的现状与挑战
肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系统常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率高，严重威胁全球公共健康。尽管肝癌的发病率和死亡率在全球长期趋势中略有下降，但五年相对生存率仍仅为 22% 。HCC 约占肝癌病例的 85%，其治疗策略包括手术切除、肝移植、消融治疗、血管内介入治疗（如经动脉化疗栓塞（TACE）、经动脉放射栓塞（TARE）和选择性内放射治疗（SIRT））以及全身抗肿瘤治疗等。
目前，晚期 HCC 的全身治疗主要是免疫疗法联合血管生成抑制剂，如阿替利珠单抗联合贝伐单抗，在临床试验中显示出比索拉非尼更好的疗效。然而，这些疗法常受严重不良反应和肿瘤异质性、微环境变化导致的耐药性限制，因此需要开发个性化治疗策略。
可靠的体外肿瘤模型是实现个性化治疗的关键工具。二维（2D）细胞模型虽广泛应用于临床前研究，但因其忽略细胞微环境变化，结果常与临床结果差异显著。相比之下，3D 培养模型能更好地揭示细胞间及细胞与基质间的相互作用，为研究疾病提供更全面的视角。
3D 细胞培养模型
3D 培养模型是对传统 2D 模型的改进，能更接近体内环境，使研究结果更具临床相关性。构建 3D HCC 模型的方法多样，球体模型因简单、成本低、可重复性高而被广泛应用，但它在模拟细胞 - 基质和细胞 - 细胞相互作用方面存在局限。
支架模型利用明胶 - 海藻酸盐水凝胶等材料，能更准确地呈现肿瘤微环境的结构；患者来源的类器官模型在重现肿瘤异质性和遗传特征方面具有优势，但建立过程复杂且不易获取。
三维生物打印技术可精确控制细胞放置、细胞外基质（ECM）组成和物理性质，虽成本高，但在构建复杂且可重复的模型方面潜力巨大。共培养系统整合基质和免疫细胞，能更准确地模拟肿瘤微环境，但因其复杂性可能影响可重复性。
在已应用的 3D HCC 细胞模型中，球体模型占比最大，为 35.5%，其次是支架模型（28.2%）和类器官模型（16.3%），水凝胶模型（12.5%）和微流体模型（7.6%）占比较小。同时，肝细胞癌类器官模型的研究呈逐年上升趋势。
类器官和球体模型
类器官是由（多能）干细胞、祖细胞和 / 或分化细胞形成的三维结构，通过细胞 - 细胞和细胞 - 基质相互作用自组织，能在体外重现天然组织结构和功能的多个方面，可分为癌类器官和非癌类器官。
HCC 类器官虽存在少量与原发肿瘤不同的突变，但总体保留了原发肿瘤的遗传改变和突变特征，且在组织学上保留了原发肿瘤的生长模式和分化程度。
为更好地反映肿瘤异质性和重现肿瘤微环境，可综合评估肿瘤的病理和分子亚型，利用高通量筛选和单细胞测序技术分析肿瘤异质性，从患者原发肿瘤的多个区域获取癌细胞，并引入多种细胞类型。
类器官模型在捕捉肿瘤微环境的关键免疫特征、复制个体生物学变化和免疫反应方面表现出色，可用于高通量药物筛选。但在优化类器官培养系统时面临挑战，包括培养条件的标准化、高通量数据的处理和分析以及类器官的稳定性和可重复性。
球体是细胞简单聚集形成的细胞聚集体，通过悬滴培养法可形成肿瘤球体，其内部能产生氧气和营养物质梯度，模拟体内肿瘤中心的缺氧环境，广泛应用于细胞实验。为满足高通量药物筛选需求，可利用微孔板阵列扩增肿瘤球体，但存在氧气供应不足的问题。
将球体与支架结合，可使肿瘤细胞在肿瘤细胞外基质中增殖，更有效地反映肿瘤真实环境。不过，肿瘤球体寿命较短，而类器官模型生物相似性更好，维护期通常更长，随着研究发展，类器官研究成本有望降低。
微流体培养系统
微流体是指长度在亚毫米范围内的流体系统，利用表面张力和毛细管力运输微流体、过滤分析物和转换多相流体。微流体技术在肿瘤微环境研究中可实现多种细胞共培养和微流体类器官研究，能节省时间成本，用于高通量药物筛选和治疗。
例如，通过将胶原蛋白与四种主要肝特异性细胞（HCC 来源的肝细胞、肝星状细胞、库普弗样巨噬细胞和内皮细胞）共培养，并结合微流体技术，构建了血管化肝细胞癌芯片，可评估癌症进展过程中的血管运输调节和栓塞及全身治疗方法的疗效。
然而，微流体技术存在复杂性高、标准化困难、部分材料可能具有细胞毒性以及数据处理和分析要求高等问题，需要生物医学、临床医学和工程学的多学科融合来推动其发展。
支架和水凝胶培养系统
3D 支架在癌症研究模型中优势显著，能准确重现肝癌微环境的复杂性，包括细胞外基质组成、机械性能及其对细胞行为的影响。不同支架被用于肝癌耐药性研究，如 HA3P50 支架为 HepG2 细胞培养提供了更生理相关的环境。
同时，有研究利用蛋白标记的聚乙二醇微凝胶构建 3D 异质微环境模型，用于评估造血干细胞（HSC）微环境重塑和代谢活性，还可筛选合适的 ECM 用于细胞 - 药物相互作用研究。
血管生成在肿瘤发生、发展和耐药中起关键作用，构建的水凝胶系统和内皮化肝肿瘤微组织模型考虑了血管因素对肿瘤微环境的影响。
支架和水凝胶培养系统能模拟肝癌微环境中的无细胞基质成分，整合多细胞共培养可重现肿瘤生长过程中的复杂细胞间相互作用，但存在复杂性高、缺乏标准化以及模拟动态环境困难等缺点。
三维生物打印技术在构建体外模型方面前景良好，利用该技术建立的 3D HCC 模型能稳定保留 HCC 特异性生物标志物（如甲胎蛋白，AFP）的表达，维持原发肿瘤的突变谱和基因表达谱。
HCC 肿瘤微环境中的非肿瘤细胞成分
HCC 中的非肿瘤细胞主要包括肝星状细胞（HSCs）、癌相关成纤维细胞（CAFs）、内皮细胞和免疫细胞，它们在肿瘤细胞增殖、迁移和耐药等肿瘤表型中发挥重要作用。
HSCs 约占肝脏总肝细胞数量的 5 - 10%，静止时储存维生素 A，分泌生长因子促进细胞周转和调节肝血管。在炎症、病毒感染或酒精等刺激下，HSCs 激活并转分化为活化的肌成纤维细胞样 HSCs，产生细胞外基质形成瘢痕组织。
研究发现 HSCs 存在不同亚群，且活化的 HSCs 可促进癌细胞增殖、转移、介导免疫抑制和耐药，还可通过分泌细胞外囊泡改变肝癌细胞代谢。利用微流体平台研究 HSCs 与 HCC 细胞的相互作用，发现铁结合蛋白 Lipocalin - 2（LCN - 2）是肿瘤微环境的关键调节因子，靶向 LCN - 2 具有强抗肿瘤作用。
CAFs 可由多种细胞分化而来，在肿瘤微环境中有多种促癌机制，如通过分泌 CCL5 促进上皮 - 间质转化（EMT），招募髓源性抑制细胞（MDSC）等。构建 CAFs 与类器官的共培养模型发现，CAFs 可促进类器官生长，但共培养系统中细胞来源不同可能影响结果。
肝窦内皮细胞（LSECs）是肝脏窦状隙中的特殊内皮细胞，在维持肝脏稳态和免疫监视中起重要作用。在肝癌中，LSECs 促进肿瘤内血管生成，参与免疫调节，但其在 HCC 治疗中的作用仍需进一步研究。
免疫疗法是 HCC 治疗的关键，但由于肿瘤异质性，免疫疗法疗效个体差异大。类器官在重建免疫微环境方面具有优势，通过与免疫细胞共培养可模拟患者肿瘤微环境。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和 T 细胞是研究较多的免疫细胞，TAMs 分为 M1 和 M2 亚型，M2 巨噬细胞在肿瘤微环境中占主导，可促进肿瘤细胞干性；T 细胞包括调节性 T 细胞和细胞毒性 T 细胞，调节性 T 细胞过多会导致肿瘤细胞免疫逃逸，目前对 T 细胞的研究多采用 2D 细胞模型和小鼠模型，3D 细胞模型应用较少。
HCC 肿瘤微环境中的 ECM 成分
HCC 微环境中的 ECM 成分包括胶原蛋白、弹性蛋白和纤连蛋白等，它们为肿瘤细胞提供黏附位点，促进细胞增殖，还在肝癌耐药和转移中发挥重要作用。
胶原蛋白是 ECM 的主要结构蛋白，在 HCC 中，其分泌主要来自肝星状细胞、成纤维细胞和肿瘤相关成纤维细胞。肝纤维化与胶原蛋白纤维过度积累密切相关，I 型胶原蛋白可刺激肝癌细胞发生 EMT，促进 YAP 过激活，增强 HCC 细胞干性。
弹性蛋白参与维持肝脏结构完整性和功能，但弹性蛋白沉积与肝纤维化有关，且其降解产物弹性蛋白衍生肽（EDPs）与氧化应激、炎症反应和胰岛素抵抗相关，目前对弹性蛋白与肝癌细胞的 3D 细胞培养模型研究较少。
纤连蛋白是 ECM 的重要成分，在 HCC 研究中发现，癌基因 MYC 可促进其表达，增强血管浸润。在 3D 细胞培养模型中，纤连蛋白主要作为细胞黏附底物，参与细胞信号转导。
结论与展望
在 HCC 研究中，从 2D 到 3D 体外模型的转变体现了研究人员对疾病理解的深入。HCC 的发生不仅与肝细胞本身有关，还与肿瘤微环境密切相关。构建针对肿瘤微环境不同成分的 3D 细胞培养模型，有助于探索肝癌细胞与微环境成分相互作用的潜在分子机制。
肿瘤球体模型应用广泛，但在模拟体内环境方面存在不足；微流体和类器官模型是当前研究热点，类器官能更好地模拟体内器官的微观结构和生物学功能，有望替代动物模型，符合 3Rs 原则（替代、减少和优化），且在预测免疫疗法疗效方面具有潜力。微流体系统可实现高通量实验；3D 支架和水凝胶培养系统聚焦于肿瘤微环境的细胞外基质成分。
肿瘤微环境由细胞和非细胞成分组成，目前多数体外模型利用与基质细胞共培养和脱细胞组织支架引入这些成分，但研究多聚焦特定因素，缺乏系统性。
医学研究需要跨学科合作，机器学习和人工智能（AI）可用于分析处理 3D 细胞模型中的复杂数据，优化实验设计。类器官共培养技术与脱细胞支架基质相结合，以及多细胞 3D 生物打印癌类器官，是有潜力的个性化临床前模型，但面临诸多挑战，需要多学科共同努力解决。
